MicroRNA-155 调节Notch 信号通路对TLCs 诱导的急性胰腺炎腺泡细胞的影响

杨亚勤，牛丽丹，孔令宇，陈希妍，任芳，杨飞云

（新乡医学院第一附属医院急诊科，河南 卫辉 453100）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是临床上常见的消化系统急性疾病，流行病学研究显示，近年来AP 的发病率呈上升趋势，且死亡率也居高不下，对人类生命安全造成严重威胁[1-2]。然而，由于AP 发病机制并不明确，临床难以取得针对性的治疗方式。研究显示微小RNA(microRNA, miRNA 非编码RNA) 在AP 患者血清中的表达出现明显差异，与AP 的发生发展及临床诊断密切相关[3-4]。郭广洋等人的研究表明，AP 患者血浆miRNA-155表达升高，其表达水平与病情严重程度密切相关[5]。动物实验结果也表明，说明miRNA-155 的表达与AP 的发生密切相关[6]。然而，miRNA-155 在AP 中的作用机制并不明确。本研究利用TLCs 诱导制造AR42J 细胞的AP 模型，检测AP 中miRNA-155 对Notch 信号通路的调控作用，初步探索miRNA-155的作用机制，为临床AP 的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠胰腺AR42J 腺泡细胞购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 主要试剂F12K 培养液购自于Sigma 公司，优质胎牛血清购自于Gibco 公司，牛磺胆酸钠盐(TLCs) 购自于Sigma 公司，Notch1 抗体，Bcl-2 抗体，Bax 抗体，Caspase-3 抗体购自于Abcam 公司，GAPDH 抗体购自于Sigma 公司。Lipofectamine 2000 转染试剂，逆转录试剂盒购自于Invitrogen 公司。microRNA-155 inhibitor，microRNA-155 negative control，pcDNA-Notch1，pcDNA negative control购自于苏州吉玛基因公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AR42J 细胞的培养 大鼠胰腺AR42J 细胞培养于的F12K 培养液中，培养液中含20%胎牛血清及青霉素100 U/mL，链霉素0.1 mg /mL，置于37℃、5 % CO2的无菌恒温培养箱中培养，2～3 d 传代1 次，实验所用细胞均为对数生长期细胞。

1.2.2 细胞的药物处理，转染及分组 细胞的药物处理：取对数生长期的AR42J 细胞，按照1X106个/mL 的浓度接种于6 孔板中，培养24 h 后用浓度为200 μM 的TLCs 刺激20 min（模型组），收集细胞，用于后续实验。

细胞转染：取对数生长期的AR42J 细胞，按照1X106 个/mL 的浓度接种于6 孔板中，按照使用说明，利用Lipofectamine 2000 将microRNA-155 inhibitor，microRNA -155 negative control，pcDNA -Notch1，pcDNA negative control 转染至AR42J 细胞后，继续培养48 h，用浓度为200 μM 的TLCs 刺激20 min，收集细胞，用于后续实验。

细胞分组：正常对照组 （Normal control group），模型组（TLCs group），TLCs+microRNA-155 inhibitor 组（TLCs+microRNA-155 inhibitor group），TLCs+microRNA-155 negative control 组（TLCs+microRNA-155 NC group），TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA negative control 组 （TLCs+microRNA-155 inhibitor +pcDNA NC group），TLCs +microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Nocth1 组 （TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Nocth1 group）。

1.2.3 RT-qPCR 检测 选取正常对照组与模型组细胞，提取细胞的总RNA，检测RNA 浓度与纯度后，利用RT-qPCR 检测细胞中microRNA-155 mRNA，Notch1 mRNA 的表达变化，miRNA-155 Forward: 5′- CGCGTTAATGCTAATCGTGAT-3′;miRNA -155 Reverse: 5′ - CGCGTTAATGCTAATCGTGAT -3′ ，Notch1 Forward: 5′ -TCAATGTTCGAGGACCAGATG-3′; Notch1Reverse: 5′-TCACTGTTGCCTGTCAAGTC-3′，所有步骤均按照试剂盒及仪器的操作说明进行，RNA 逆转录成cDNA 后，进行扩增，反应条件:预变性94，30 s、变性94，5 s、退火55，30 s、延伸72，30 s；共40 个循环。

1.2.4 ELISA 检测 将AR42J 细胞接种于6 孔板中，处理细胞后按照试剂盒说明书检测各组细胞培养液中IL-6，IL-32，IL-1β 及TNF-α 的含量，利用酶标仪检测吸光度值，计算各组细胞培养液中细胞因子的含量（pg/mL）。

1.2.5 Western blot 检测 分别提取各组细胞总蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，转膜，10%的脱脂奶粉封闭膜1 h，4℃孵育Ⅰ抗过夜，Ⅰ抗体浓度分别是Bcl-2 抗体（1∶500），Bax 抗体（1∶500），caspase-3（1∶500）及GAPDH 抗体（1∶10000），荧光II 抗（1∶1000）孵育2 h，利用Odyssey 曝光系统曝光，利用Image J 软件分析灰度值。

2 结果

2.1 miRNA-155 与Notch1 在TLCs 诱导的AR42J细胞模型中的表达 正常对照组相比较，TLCs 组AR42J 细胞中miRNA-155 mRNA 的表达显著升高（P<0.01），而Notch1mRNA 及Notch1 蛋白的表达显著上调（P<0.01）。这些结果提示，在TLCs 诱导下，AR42J 细胞中miRNA-155 与Notch1 的表达均上调，见图1。

图1 miRNA-155 与Notch1 在TLCs诱导的AR42J 细胞中的表达

2.2 抑制miRNA-155 的表达对Notch1 的影响 与TLCs 组相比较，miRNA-155 inhibitor 组Notch1 mRNA 与蛋白的表达均显著降低 （P<0.01）；而miRNA-155 NC 组与TLCs 组相比较，Notch1 mRNA 与蛋白的表达并无明显改变。结果说明，抑制模型组细胞中miRNA-155 的表达后，细胞中Notch1 的表达显著降低，miRNA-155 可正向调节Notch1 的表达，见图2。

图2 miRNA-155 抑制剂对TLCs 诱导的AR42J 细胞中Notch1 表达的影响

2.3 抑制miRNA-155 的表达对细胞凋亡相关蛋白的影响 正常对照组相比较，TLCs 组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著下降，凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达显著升高；而与TLCs 组相比较，TLCs+miRNA-155 inhibitor 组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著下降，凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达显著升高。提示，在TLCs 诱导的AR42J细胞模型中，miRNA-155 可促进抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，抑制凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达，抑制损伤细胞的凋亡，而抑制miRNA-155 后可促进损伤细胞的凋亡，见图3、表1。

表1 miRNA-155 抑制剂对TLCs 诱导的AR42J 细胞中Bcl-2, Bax 与Caspase-3 表达的影响

图3 miRNA-155 抑制剂对TLCs 诱导的AR42J细胞中Bcl-2, Bax 与Caspase-3 表达的影响

2.4 抑制miRNA-155 与Notch1 的表达后，对细胞凋亡相关蛋白的影响 TLCs+miRNA-155 NC 组相比较，TLCs+miRNA-155 inhibitor 组AR42J 细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著下降，凋亡蛋白Bax与Caspase-3 的表达显著升高；而与TLCs+miRNA-155 inhibitor 相比较，TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Notch1 组，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著升高，凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达显著降低。这些结果提示，在TLCs 诱导的AR42J 细胞模型中，抑制miRNA-155 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，促进凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达，促进损伤细胞的凋亡，而过表达Notch1 可逆转抑制miRNA-155 对损伤细胞的作用，抑制细胞凋亡，见图4。

图4 抑制Notch1 可逆转miRNA-155 抑制剂对TLCs 诱导的AR42J 细胞中Bcl-2, Bax 与caspase-3 蛋白表达的影响

表2 抑制Notch1 可逆转miRNA-155 抑制剂对TLCs 诱导的AR42J 细胞中Bcl-2, Bax 与caspase-3 蛋白表达的影响

2.5 抑制miRNA-155 与Notch1 的表达后对细胞炎性因子的影响 正常对照组相比较，TLCs 模型组细胞中炎性因子IL-6，IL-32，IL-1β 及TNF-α 的含量显著升高；与TLCs 组相比较，TLCs+microRNA-155 inhibitor 组细胞中它们的含量显著下降；与TLCs+microRNA-155 inhibitor 组相比较，TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Notch1 组细胞中它们含量显著升高。这些结果说明，抑制microRNA-155 可减轻TLCs 诱导的AR42J 细胞损伤，减少炎性因子的释放，而过表达Notch1 可逆转了抑制microRNA-155 对TLCs 诱导的AR42J 细胞损伤的作用,促进炎性因子的释放，见表3。

表3 抑制miRNA-155 与过表达Notch1 对TLCs 诱导的AR42J 细胞中炎性因子的影响。

3 讨论

早期的研究显示当AP 发生时，腺泡细胞往往会发生两种情况，即坏死与凋亡，前者与胰腺炎的严重程度呈正相关，后者与胰腺炎严重程度呈负相关，因此，抑制细胞坏死，促进细胞凋亡可减轻AP 的进一步恶化[7]。通过靶向治疗减少腺泡细胞坏死，促进其凋亡可成为临床治疗AP 的新的策略。

Notch 信号通路通过配体与受体的结合，引发细胞内部一系列的蛋白分解，激活其下游靶基因的转录，参与调解细胞的凋亡[8]。动物实验研究显示，Notch 信号通路参与小鼠AP 模型中细胞的凋亡[9]，通过过度表达Notch1 可抑制胰腺细胞的凋亡，从而促使AP 的恶化[10]。

近年来，microRNA 的研究显示，多个miRNA参与AP 的发生发展，与诊断和预后相关[11-12,5],其中miRNA-155 的表达与AP 的发生密切相关[6]。本研究的结果也显示，miRNA-155 在模型细胞中的表达显著升高，同时Notch1 的表达也升高，这也与文献报道相一致。房裕钞等人的研究显示，miRNA-155 通过调控Notch 信号通路参与脑缺血-再灌注损伤[13]，那么miRNA-155 是否是通过调控Notch信号通路参与对AP 的影响，还未见报道。

本研究中，抑制模型细胞中miRNA-155 表达后，细胞中Notch1 的表达也显著下降；抑制miRNA-155 后抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达降低，而凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达升高；同时过表达Notch1 后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达升高，而凋亡蛋白Bax 与Caspase-3 的表达降低。这些结果表明在AP 中，miRNA-155 正向调控Notch 信号通路，抑制miRNA-155 的表达后，可抑制Notch 信号通路的激活，进而促进AR42J 细胞凋亡，而过表达Notch1 后，可逆转抑制miRNA-155 对TLCs 诱导的AR42J 细胞的作用，抑制了细胞凋亡。

血清中TNF-α 及IL-6 等水平与炎性疾病的发展密切相关[14]，抑制miRNA-155 通过靶向SIRT1缓解糖尿病小鼠高糖诱导的足细胞炎症[15]。吕芳等人的研究表明，在AP 大鼠模型中，IL-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α 水平显示高表达，它们的水平升高也反应了机体的炎性状态，在对AP 诊断中具有重要意义，四项联合检测可以提高诊断效率[16]。本研究中，抑制模型细胞中miRNA-155 表达后，细胞培养液中IL-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α 水平显著下降；同时过表达Notch1 后，它们的水平显著升高，表明在AP 中，抑制miRNA-155 的表达后，可减轻TLCs 诱导的AR42J 细胞损伤，而过表达Notch1 后，可逆转抑制miRNA-155 对AR42J 细胞损伤的减轻作用，促进细胞损伤。

综上所述，在TLCs 诱导的AP 模型AR42J 细胞中，通过抑制miRNA-155 可靶向下调Notch1 表达，抑制Notch 信号通路的激活，促进细胞凋亡，抑制炎性因子的释放，从而减轻TLCs 诱导的AP 模型细胞AR42J 的损伤。本研究结果表明，miRNA-155 和Notch 信号通路是AP 的潜在分子靶点，可为临床AP 的治疗提供了新的策略。