CMKLR1 三种检测方法在宫颈癌中的表达及临床意义

孙海芹，程希花，王彦红

（1.鹤壁市妇幼保健院妇女保健科；2.妇产科；3.检验科，河南 鹤壁 458030）

宫颈癌是全球女性最常见恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高，且具有一定地域差异性，以发展中国家最为多见，而我国是一个人口大国，占比较大[1]。随着科技不断进步，宫颈癌早期筛查、诊断及预防不断普及，大部分国家死亡率整体下降，而我国则未见明显改善，甚至有上升趋势，认为与宫颈癌危险暴露因素增加有关[2]。个体性行为是其关键危险因素，女性首次性行为年龄提前，性行为次数及伴侣增加，越来越多年轻女性存在慢性宫颈炎和宫颈鳞状上皮内病变，最终部分可发展为宫颈癌，影响生活质量，威胁其生命[3]。目前，肿瘤研究多涉及微观领域，科研工作者力求从分子水平完成肿瘤的诊断、治疗及预后评估；近年研究发现趋化因子及趋化因子受体不仅可在大部分肿瘤细胞中广泛表达，还可参与其增殖、转移及侵袭等[4-5]。但关于趋化因子受体1(Chemokine receptor-like 1，CMKLR1)与宫颈癌的研究报道较少。本研究采用实时荧光PCR （Real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-FPCR）、免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）和酶联免疫吸附法（EnzymeLinked Immunosor-bent Assay,ELISA）检测CMKLR1 在宫颈癌、宫颈鳞状上皮内病变和慢性宫颈炎中的表达差异，并分析其与宫颈癌临床特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015 年2 月至2018 年2 月鹤壁市妇幼保健院收治的125 例宫颈癌患者、92例宫颈鳞状上皮内病变患者和66 例慢性宫颈炎患者作为研究对象，分别命名为宫颈癌组、宫颈鳞状上皮内病变组和宫颈炎组，同期选取40 例健康女性作为对照组。纳入标准:宫颈癌（1）临床表现、实验室及病理结果均证实为宫颈癌者，且FIGO 分期在I-III 间者；（2）均行手术治疗且预期生存期>3月者；（3）临床及随访资料完整者；（4）排除合并其它恶性肿瘤者；（5）排除非肿瘤原因死亡者；宫颈鳞状上皮内病变（1）阴道镜及病理结果提示为宫颈鳞状上皮内病变者；（2）排除合并其它恶性肿瘤者；慢性宫颈炎（1）临床表现、实验室检查及阴道镜检查均提示为慢性宫颈炎者；（2）排除合并宫颈鳞状上皮内病变和或宫颈癌者。4 组受试者年龄比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，且通过鹤壁市妇幼保健院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 采用RT-FPCR 检测CMKLR1 mRNA 手术切下癌组织和癌旁正常组织于30 min 内置于RNA 保存液中，-80℃冰箱保存待检测：待集齐后进行RT-FPCR 检测。第一，总RNA 提取和cDNA制备，参照CMKLR1 RNA 提取和逆转录试剂盒说明书完成检测；第二，RT-FPCR 检测，用Pubmed中BLAST 软件设计CMKLR1 引物，其中内参基因是GAPDH，配置PCR 扩增体系（20 μL），设置扩增条件后上机进行检测，并计算CMKLR1 mRNA 相对表达水平。其中QuantStudio5 实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司，试剂盒均购自美国Sigma 公司。

1.2.2 采用IHC 检测组织CMKLR1 蛋白 取病理科石蜡块进行切片、脱蜡及抗原修复后加入CMKLR1 单克隆抗体（1:300），4℃过夜，第2 d，缓冲液洗3 次，后加入二抗，室温孵育30 min （避光）；后经二氨基联苯胺（DAB）染色、苏木精复染、脱水、透明及封片后阅片。本研究采用双盲阅片法，统一阅片标准后由两位高年资质病理医师完成。其中CMKLR1 单克隆抗体购自美国Abcam 公司，产品批号为201905。

结果判定：CMKLR1 蛋白主要位于细胞质，肿瘤细胞胞质中出现棕黄色或黄色颗粒则认定为阳性细胞，根据阳性细胞百分率不同记为：无阳性细胞0 分；≤10% 1 分；11%～49% 2 分；≥50% 3 分。根据着色强度不同记为：无着色0 分；淡黄色1分；黄色2 分；棕褐色3 分。两者乘积计分：阳性为≥4 分者；阴性为0～3 分者。

1.2.3 采用ELISA 检测血清CMKLR1 收集所有研究对象入组第1 d 空腹外周血5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清于液氮快速冻存后转移至-80℃冰箱保存待用；待所有标本集齐后参照血清CMKLR1-ELISA 检测试剂盒说明书完成检测，于波长450 nm 酶标仪上读取OD 值，绘制曲线获取CMKLR1 浓度。其中试剂盒购自上海酶联免疫生物有限公司，产品批号为201912。

1.3 随访 对宫颈癌患者随访3 年，截止日期为2021 年2 月1 日，无因其它原因中途退出者，记录其总生存期 (Overall Survival,OS) 和无病生存期(Disease-free survival,DFS)。

1.4 统计学方法 本研究所有数据均采用SPSS20.0 统计学软件进行分析，其中计量资料用（±s）描述，2 组间比较采用t 检验，2 组以上比较采用单因素方差分析；计数资料用构成比描述，用χ2检验进行比较；采用Kaplan-Meier 法和Logrank 法进行生存分析；用Pearson 相关分析血清CMKLR1 与组织CMKLR1 mRNA 和CMKLR1 蛋白的关系；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组CMKLR1 mRNA 比较 宫颈癌组、宫颈鳞状上皮内病变组和宫颈炎组3 组组织中CMKLR1 mRNA 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且表现为宫颈癌组＞宫颈鳞状上皮内病变组＞宫颈炎组。见表1。

表1 3 组CMKLR1 mRNA 比较（±s）

表1 3 组CMKLR1 mRNA 比较（±s）

注：与宫颈炎组比较，at=20.889,aP=0.000；与宫颈鳞状上皮内病变组比较，bt=21.949,bP=0.000。

组别n宫颈癌组宫颈鳞状上皮内病变组宫颈炎组125 92 66 FP CMKLR1 mRNA 5.951.03b 3.340.57a 1.850.12 14.492 0.001

2.2 宫颈癌组癌组织和癌旁正常组织CMKLR1 比较 与癌旁正常组织比较，宫颈癌组癌组织CMKLR1 mRNA 和CMKLR1 蛋白阳性率均明显升高，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 癌组织和癌旁正常组织CMKLR1 蛋白免疫组化图

表2 宫颈癌组癌组织和癌旁正常组织CMKLR1 比较（%,±s）

表2 宫颈癌组癌组织和癌旁正常组织CMKLR1 比较（%,±s）

类别n CMKLR1 蛋白阳性阴性癌组织癌旁正常组织125 125 80（64.00）24（19.20）45（36.00）101（80.80）trP CMKLR1 mRNA 5.951.03 1.240.22 44.998 0.000 51.633 0.000

2.3 CMKLR1 蛋白与宫颈癌临床特征的相关性CMKLR1 蛋白在FIGO 分期、肌层浸润和淋巴转移上差异表达，且有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 CMKLR1 蛋白与宫颈癌临床特征的相关性

2.4 CMKLR1 蛋白与宫颈癌预后的关系 经3 年随访，CMKLR1 蛋白阳性表达者OS 生存率（29/80）和DFS 生存率（26/80）明显低于阴性表达者[（30/45）和 （27/45）]（r=10.692，P=0.001；r=8.918，P=0.003）。见图2。

图2 CMKLR1 蛋白与宫颈癌预后的关系

2.5 4 组血清CMKLR1 比较 宫颈癌组、宫颈鳞状上皮内病变组、宫颈炎组和对照组4 组血清CMKLR1 比较，差异有统计学意义（P<0.05），且表现为宫颈癌组>宫颈鳞状上皮内病变组>宫颈炎组>对照组。见表4。

表4 3 组CMKLR1 mRNA 比较（±s）

表4 3 组CMKLR1 mRNA 比较（±s）

注：对照组与宫颈炎组比较，aP<0.05；宫颈炎组与宫颈鳞状上皮内病变组比较，bP<0.05；宫颈鳞状上皮内病变组与宫颈癌组比较，cP<0.05。

组别宫颈癌组宫颈鳞状上皮内病变组宫颈炎组对照组n 125 92 66 40 FP CMKLR1（μg/L）40.25±7.63c 33.59±6.11b 28.75±5.21a 26.49±4.88 70.452 0.000

2.6 Pearson 相关分析 经Pearson 相关分析得知，血清 CMKLR1 与组织 CMKLR1 mRNA 及CMKLR1 蛋白均呈明显正相关（P<0.05），其相关系数分别为0.471 和0.448。

3 讨论

宫颈癌死亡率较高，浸润转移是关键因素，与肿瘤微环境状态密切相关，而趋化因子及受体是肿瘤微环境重要组成成分之一，与肿瘤发生发展密切相关，已在肺癌及头颈部鳞状细胞癌中到证实[6-8]。CMKLR1 在1996 年被Gantz 等[9]报道，是新近重要的趋化因子受体，属于G 蛋白偶联受体（GPCR），但未见其配体，在白色脂肪组织和巨噬细胞等中显著表达。有学者发现[10]，CMKLR1 是Chemerin 发挥生物学功能的主要受体，后者可趋化高表达CMKLR1 的巨噬细胞和树突状细胞，参与各类细胞代谢、增殖及免疫应答等生命过程中发挥重要作用。近年，越来越多研究表明[11-12]，Chemerin 可与内皮细胞膜上CMKLR1 受体结合，诱导内皮细胞增殖，促进肿瘤新生血管丛形成，在肿瘤细胞生长增殖中占有一定地位，内源性CMKLR1 可能参与子宫内膜癌进展及转移，为子宫内膜癌临床治疗提供新的途径。

本研究发现，CMKLR1 mRNA 水平在宫颈癌组、宫颈鳞状上皮内病变组和宫颈炎组依次减少；宫颈癌组癌组织CMKLR1 蛋白阳性率明显高于癌旁正常组织，证实CMKLR1 在宫颈癌中高表达，从基因和蛋白水平证明了CMKLR1 在宫颈癌中的“原癌基因”角色。本研究通过分析CMKLR1 蛋白与宫颈癌临床特征的相关性发现CMKLR1 蛋白在FIGO 分期、肌层浸润和淋巴转移上差异表达，且FIGO 分期越高、肌层浸润越深及存在淋巴转移者，CMKLR1 蛋白阳性率越高，分析原因，CMKLR1 高表达可增加肿瘤新生血管丛形成速率，加快癌细胞侵袭转移速率。此外，本研究通过Kaplan-Meier法和Log-rank 法分析CMKLR1 蛋白与宫颈癌预后的关系发现CMKLR1 蛋白阳性表达者OS 生存率（29/80）和DFS 生存率（26/80）明显低于阴性表达者，提示CMKLR1 对宫颈癌患者预后评估的价值。尽管如此，无创检查才是未来疾病诊疗的主流，血清学检测占比较大，为此本研究还进行了宫颈癌组、宫颈鳞状上皮内病变组、宫颈炎组和对照组的血清CMKLR1 检测，发现血清CMKLR1 在以上组别中逐渐降低，基本与组织CMKLR1-mRNA变化吻合，为验证此猜想本研究还进行了Pearson相关分析，发现血清CMKLR1 与组织CMKLR1 mRNA 及CMKLR1 蛋白均呈明显正相关，说明血清CMKLR1 变化与病变组织CMKLR1 mRNA 及蛋白改变一致，提示血清CMKLR1 检测有望替代侵入性检查之组织mRNA+蛋白检测，成为宫颈癌诊疗及预后评估的有效指标。

综上，CMKLR1 在宫颈癌中高表达，且与FIGO 分期、肌层浸润和淋巴转移相关，可作为宫颈癌患者预后评估的重要指标之一。