基于网络药理学与数据挖掘的中医药治疗心力衰竭物质基础及用药规律研究

刘 仔,张 丽,邝惠珍,李俊杰

(东莞市中医院药学部,广东 东莞 523127)

一项基于5000万人口全国城镇职工基本医疗保险数据的调查显示,在我国≥25岁人群中HF的年龄标准化患病率是1.10%,预估现有患病人数达1210万,每年新发病患者300万[1]。美国一项对来自254家医院39982名HF患者进行的风险调整生存分析发现,射血分数下降的心衰(EF≤40%)、射血分数临界的心衰(EF 41%to 49%)、射血分数保留的心衰HFpEF住院患者5年死亡率分别是75.3%、75.7%、75.7%[2]。降低HF患者死亡率、稳定病情、提高生存质量成为临床关注的重点和难点。

HF现有治疗药物主要是肾素-血管紧张素系统抑制剂(ACEI/ARB/ARNI)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂、利尿剂等。虽然心衰治疗现代理念和手段在不断进步,但在西医治疗基础上,针对不同心衰阶段的不同证型加用中医治疗,可有效改善慢性心衰患者临床症状和生活质量,维持心功能,减少再住院率[3]。

本研究以全面系统收集整理HF相关靶点为切入点,基于网络药理学和分子对接方法,寻找潜在中药及活性化合物,构建疾病-靶点-化合物-中药网络,探讨中医药治疗HF的药效物质基础,以期为临床治疗HF及相关药学研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 心力衰竭相关作用靶点收集

登录GeneCard、OMIM、DrugBank、DisGeNET数据平台,以“heart failure”为关键词进行检索,获得HF相关{Wang,2021#1}靶点,并使用UniProt匹配靶点全称。

1.2 候选化合物筛选及靶点-化合物网络构建

检索TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[4]收集与HF靶点相关的化合物信息。根据ADME参数及Lipinski规则对候选化合物进行筛选。通过查询文献对删除的化合物活性进行逐一确认,补充相关活性化合物。以上所得化合物视为候选化合物。使用Cytoscape 3.8.0构建潜在靶点-候选化合物网络。

1.3 中药筛选及靶点-化合物-中药网络构建

检索TCMSP收集含有候选化合物的中药,构建化合物-中药网络,结合靶点-化合物网络,利用Cytoscape3.8.0构建靶点-化合物-中药网络并计算网络中各节点的拓扑学参数以确定关键节点,初步评估中药及相关化合物对HF的调节作用。

1.4 中药类别及性味归经分析

查询2020版《中华人民共和国药典》[5]、第3版《全国中草药汇编》[6]、全国高等中医药院校规划教材第十一版《中药学》获取“1.3”项下中药类别及性味归经信息,并进行频数统计分析。在上述资料中无相关信息时不予统计该药。

1.5 靶点-候选化合物分子对接

选取“靶点-化合物-中药网络”中度值排名前5位的核心靶点作为受体,与网络中的核心成分进行分子对接。

查询RSCB PDB数据库(https://www.pdbus.org/),选取5种蛋白的晶体结构。使用AutoDock Tools 1.5.6及PyMOL 2.3对蛋白晶体、化合物进行删除原始配体、去水、加氢等前处理,保存为.pdbqt格式文件。运用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接,预测蛋白质受体与化合物配体的结合模式和结合能值。

2 结果

2.1 心力衰竭相关靶点

通过GeneCard、OMIM、DrugBank、DisGeNET数据库分别获得HF相关靶点54、133、65、109个,将靶点去重处理并经UniProt规范,获得HF相关靶点323个,查询TCMSP有对应化合物的靶点有69个,经ADME及Lipinski规则筛选后所得化合物对应的靶点有35个,分别是ADRA2C、ADRB1、ADRB2、PTGS2、SCN5A、CHRM4、KCNH2、IL6、LTA4H、TNF、NR3C2、BIRC5、CXCL2、CYP1A1、CYP3A4、GJA1、HIF1A、HSF1、MAPK1、MMP2、MMP3、PPARG、TP53、XDH、CYP2C9、EDN1、ECE1、BMPR2、CD36、CES1、ACLY、NOX1、FOSL1、OLR1、SLC12A1,将它们定义为潜在靶点。

2.2 候选化合物及靶点-化合物网络

经检索TCMSP平台,323个HF靶点中有69个能关联到中药成分,关联化合物共计4090个。关联化合物经过ADME参数及Lipinski规则筛选,并通过查询文献补充4个活性化合物,共筛选得到891个候选化合物。构建潜在靶点与候选化合物的靶点-化合物网络,得到度值前9的化合物为槲皮素、丹参酮ⅡA、木犀草素、胡椒碱、卡维丁、异胡椒脂碱、牡丹草碱、育亨宾碱、隐丹参酮,这些化合物可作用于多个HF相关靶点而具有较强活性,可考虑对其进一步深入研究。度值排前9的靶点为PTGS2、SCN5A、ADRB2、KCNH2、NR3C2、CHRM4、ADRA2C、ADRB1、LTA4H,分别对应735、395、267、163、133、87、45、43、35个化合物,与HF发生机制相关性较高,可作为进一步研究的主要靶点。

2.3 匹配中药及靶点-化合物-中药网络

891个候选化合物在TCMSP平台关联得到445味中药,根据关联关系构建化合物-中药网络。其中度值前11的中药为甘草、丹参、钩藤、黄芩、延胡索、板蓝根、降香、半枝莲、苦参、白屈菜、苦地丁,分别含候选化合物65、43、29、27、26、22、22、21、21、19、19个。通过候选化合物桥接作用统计关联靶点数≥24的中药有21个,分别为银杏叶、延胡索、白果、半枝莲、大枣、甘草、红芪、黄柏、黄连、金盏菊花、没药、木蝴蝶、青蒿、沙棘、山楂叶、土茯苓、菟丝子、夏枯草、香附、洋金花、皂角刺,推测这21种中药对HF有干预作用,可为临床遣方用药及试验研究提供支撑信息。

对关联靶点数≥24的中药及其关联化合物、靶点构建网络,见图1。图中节点大小与度值正相关,圆形代表化合物,菱形代表靶点,六边形代表中药。

图1 靶点-化合物-中药网络图(中药关联靶点数≥24)

2.4 中药类别及性味归经

对445味中药的类别及性味归经进行频数统计分析。结果显示潜在可干预HF的中药类别以清热药(17.3%)、补虚药(11.6%)、化痰止咳平喘药(10.6%)、解表药(8.5%)、利水渗湿药(7.9%)、活血化瘀药(7.0%)、理气药(7.0%)为主,上述七类中药累计占比69.9%。药味频率较高者为苦、辛、甘,药性寒温并重。归经方面,肝经占比最高(47.0%),其次为肺经(38.0%)、胃经(30.8%),具体频次见图2。

图2 干预心力衰竭中药归经分布

2.5 分子对接结果

30个核心成分(Degree≥6)与5个核心靶点PTGS2(PDB ID:5IKQ)、SCN5A(PDB ID:4DCK)、ADRB2(PDB ID:6PS2)、KCNH2(PDB ID:6SYG)、NR3C2(PDB ID:3VHV)的对接得分见对接得分热图3。

图3 干预心力衰竭潜在核心成分与核心靶点分子对接得分热图

150组对接组合中,有99组为靶点-化合物网络中的组合,其中有60组Affinity<-7.0 kcal/mol,对接得分最高的是PTGS2-alpha-berbine(-10.0 kcal/mol),得分最低的是KCNH2-leonticine(-5.4 kcal/mol),网内99个组合平均对接得分-7.5 kcal/mol,表明潜在核心成分与核心靶点之间可能有较好的对接活性。51组网外组合中,有20组Affinity<-7.0 kcal/mol,Affinity前3位的是NR3C2-luteolin(-9.1 kcal/mol)、NR3C2-6-Methoxyflavone(-9.1 kcal/mol)、NR3C2-fisetin(-9.0kcal/mol)。

综合考虑分子对接Affinity值及成分在网络中的度值,选择其中4组进行可视化展示,见图4。

A:PTGS2与quercetin分子对接模型

3 讨论

中医用药讲究临证化裁,加上中药成分具有复杂性,对人体疾病的调节往往是多靶点、多通路的,网络药理学可系统、整体、高效的分析疾病与药物涉及靶点的相关性,有助于揭示中医药治疗心衰的药效物质基础和作用机制。

本文对HF靶点进行了较为全面的收集整理,筛选出35个潜在靶点,其中能关联较多候选化合物的靶点有PTGS2、SCN5A、ADRB2、KCNH2、NR3C2、CHRM4、ADRA2C、ADRB1等,已有研究表明这些靶点与HF之间存在相关性。例如由PTGS2编码的环氧合酶2(COX2)在非缺血性HF患者中具有高表达水平[7]。SCN5A编码的电压门控钠离子通道(Nav1.5)是心脏中表达的主要电压门控钠通道,该通道通过产生快速钠内流启动心脏动作电位,Nav1.5功能障碍与包括HF在内的多种先天性或获得性心脏病相关[8]。

本研究在全面收集整理HF靶点的基础上,筛选出能作用于较多HF靶点的化合物有槲皮素、丹参酮ⅡA、木犀草素、隐丹参酮等。有研究表明,槲皮素可能通过SIRT5促进IDH2的去琥珀酸化,维持线粒体稳态,保护炎症状态下的小鼠心肌细胞,并改善心肌纤维化,从而降低HF的发生率[9]。丹参酮ⅡA通过抑制细胞凋亡和激活AMPK-mTOR信号通路诱导自噬保护心肌细胞并改善心脏功能,抑制氧化应激改善HF大鼠的心功能障碍和纤维化[10]。

为更深一步评估上述核心靶点及成分之间的结合活性,本研究利用计算机分子对接技术做了进一步验证。所选取的度值排名靠前的核心靶点与核心成分的分子对接结果显示,大多数靶点-化合物网络内的成分和靶点之间有着强结合力,进一步验证了本文构建的靶点-化合物网络具有一定的预测意义,可为进一步研究中药治疗HF的有效成分提供参考。

通过构建靶点-化合物-中药网络,得到了能映射较多HF靶点的银杏叶、延胡索、白果、半枝莲等21种中药,推测这些中药对HF具有干预作用。

在中药类别分析部分有意思的是,频次靠前中药还出现了清热药、解表药,并且清热药占比最高,这些清热药、解表药在治疗HF方面是否真正具有临床应用价值及如何让HF患者获益尚值得进一步研究。性味归经方面,潜在可干预HF的中药药味以苦、辛、甘为多,归经以肝、肺经为主。性味归经频数分析结果与中医治疗HF时使用益气养阴或益气温阳固本,活血、利水、化痰治标的治疗大法相一致,可为进一步解释中医药治疗HF的作用机制提供参考。

综上所述,本研究基于网络药理学、数据挖掘及分子对接等研究方法,较为系统的探讨了中医药治疗HF可能的物质基础及用药规律,可为临床治疗HF及相关药学研究提供参考。但因为本研究数据基本来源于网络数据库及通过软件计算所得,后续可尝试选取映射靶点多的中药,通过实验对其发挥抗HF作用的物质基础、药理作用、量效关系等作进一步研究。