UHPLC-Q-Orbitrap HRMS测定乌龙茶中呈味核苷酸及铁观音做青过程中呈味核苷酸变化分析

黄艳，周孝森，高晨曦，张灵枝，荣杰峰，孙威江*

UHPLC-Q-Orbitrap HRMS测定乌龙茶中呈味核苷酸及铁观音做青过程中呈味核苷酸变化分析

黄艳1,2，周孝森1,3，高晨曦2，张灵枝2，荣杰峰4*，孙威江2*

1. 福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362400；2. 福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002； 3. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；4. 泉州海关综合技术服务中心，福建 泉州 362000

核苷酸是茶叶中核酸和咖啡碱生物合成的重要底物，也是茶汤中重要的鲜味物质之一。建立了一种超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）测定核苷酸含量的分析方法，可在4 min内测定茶叶中胞苷-5'-单磷酸（CMP）、尿苷-5'-单磷酸（UMP）、腺苷-5'-单磷酸（AMP）、肌苷-5'-单磷酸（IMP）和鸟苷-5'-单磷酸（GMP）等5种呈味核苷酸，并分析这5种核苷酸在铁观音做青过程中含量的变化规律。结果表明，5种核苷酸的检出限为0.87～1.47 μg·g-1，定量限为2.62～4.41 μg·g-1，线性范围为50～1 000 ng·mL-1，日内精密度和日间精密度分别为2.17%～4.17%和2.95%～4.74%，回收率为72.89%～91.98%；铁观音茶树品种可检测出UMP、CMP和AMP 3种核苷酸，含量分别为16.98～26.78、14.31～17.56、7.80～9.91 μg·g-1，由高到低依次为UMP、CMP、AMP，CMP在做青后期缓慢增加；呈味核苷酸总量变化范围为40.78～56.69 μg·g-1，呈现稳定性波动。该方法快速准确、灵敏度高、稳定性和精密度好，可为茶叶加工过程中风味化学物质分析的研究提供技术支持。

铁观音；鲜味；做青；呈味核苷酸

核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是生物体核酸合成的前体物质，也是人体健康所需的必要成分[1]。食品中的鲜味化合物除了以谷氨酸钠为代表的氨基酸类、肽胺、肽等化合物以外，还包括5'-核苷酸。核苷酸的核糖上有3个自由基团，通过与磷酸缩合作用产生5'-核苷酸、3'-核苷酸和2'-核苷酸等3种不同的核苷酸异构体，只有磷酸基连接在5'-碳原子上且磷酸基中2个羧基解离，才能产生肌苷-5'-单磷酸（IMP）、鸟苷-5'-单磷酸（GMP）、胞苷-5'-单磷酸（CMP）、尿苷-5'-单磷酸（UMP）等鲜味核苷酸类化合物，其中IMP和GMP为主的核苷酸类[2-4]是主要的鲜味核苷酸。此外，核苷酸能与氨基酸产生协同效应，提高食品风味[5-7]。

鲜味是5种基本味觉（咸、甜、苦、酸、鲜）之一，具有调节食欲、预防慢性疾病和减少脂肪摄取[8]等功效。鲜味是茶叶中重要的风味属性，研究茶叶中呈鲜味核苷酸的特征，对分析茶叶的品质和保健功效具有重要的科学价值。呈味核苷酸能够提高茶叶风味，调味茶通过添加呈味核苷酸增加风味[9]；适当添加IMP和GMP，能降低表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallatecatechin gallate，EGCG）的涩味，提高回甘生津的效果[4]；呈味核苷酸也能提高白茶茶汤的醇厚度[10]。

作为闽南乌龙茶的代表，清香型铁观音鲜度特征凸显，拥有与绿茶类似的鲜爽品质。摇晾结合的做青工序是形成鲜味的关键环节，较少研究从乌龙茶的加工风味化学层面，探讨做青过程中游离态核苷酸的变化与茶汤鲜味的关系。现有定量分析核苷、核苷酸和碱基的检测方法主要包括毛细管电泳法[11]、液相色谱法[12-16]、离子交换高效液相色谱法[17]、荧光定量高效液相色谱法[18]、液相色谱-质谱联用法[19-21]、亲水色谱-高分辨率质谱联用法[22-23]等。离子交换色谱法因高盐流动相的使用，无法与质谱联用[25]；毛细管电泳法测定数据可靠、灵敏度高，但操作复杂且成本高。茶叶中游离核苷酸含量低、次生代谢产物的干扰因素多，分析技术难度较大，单纯的液相色谱分析准确性不高，与高分辨质谱联用，保证定性色谱峰和定量检测同时进行，可缩短分析时间、提高色谱峰的分辨率和灵敏度[23]，适用于以茶叶为代表的复杂基质中多种核苷酸类化合物检测。本研究建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）测定茶叶中游离核苷酸含量的分析方法，并探讨乌龙茶做青过程中呈味核苷酸的动态变化，旨在为乌龙茶加工风味化学研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统、Vanquish UHPLC超高效液相色谱系统，美国Thermo Scientific公司；NBS-U410型超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司；ALPHA1-4 LD plus型真空冷冻干燥机，德国Christ公司；电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Vortex2涡旋振荡仪，德国IKA仪器设备有限公司；BDP-20TJ型超纯水机，南京权坤生物科技有限公司；HWS-24型恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；SC-3610型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；UC-7600超声波机，深圳佳源达科技有限公司；Acquity UPLC C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），美国Waters公司；0.22 μm PTFE针式滤膜，Biosharp生物科技公司；6CWY-85摇青机，福建佳友茶叶机械智能科技股份有限公司。

1.2 主要试剂与药品

CMP、UMP、IMP、GMP和腺苷-5'-单磷酸（AMP）标准品购于中国计量科学院标准物质中心，纯度均≥98%；UPLC级乙腈、甲酸和乙酸购于德国Merk公司。

1.3 茶样制备

乌龙茶做青包括摇青和晾青。于2020年9月采收安溪县铁观音品种的一芽三叶新梢，按照传统安溪铁观音的“三摇三晾”的中等发酵程度做青，具体步骤见表1（摇青使用6CWY -85摇青机，晾青使用直径106 cm有孔竹筛及晾青架）。在做青的一摇（时间2 min）、一晾（时间70 min）、二摇（时间4 min）、二晾（时间83 min）、三摇（时间23 min）、三晾（时间140 min）的每个环节取样，3次重复，共18个样品。每个样品各取200 g，液氮固定后放入–80 ℃冰箱保存。样品使用前，真空冷冻干燥至含水率5%以内，取叶片部位，用预冷的研钵磨成100目茶粉，待用。

1.4 试验方法

1.4.1 核苷酸提取

用分析天平称取0.200 g茶粉放入15 mL离心管中，加入10 mL超纯水，涡旋振荡2 min混合均匀。将离心管放入100 ℃恒温水浴锅中浸提10 min后，超声波辅助提取10 min，提取出大部分的核苷酸，随后5 000 r·min-1离心10 min取上清液用0.22 μm PTFE膜过滤，转入进样瓶中待测，可放入4 ℃冰箱保存1周。

1.4.2 标准溶液的制备

准确称取适量的5种核苷酸标准品，以超纯水为溶剂，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的混合标准储备溶液。取标准储备溶液添加适量纯水分别稀释成质量浓度为50、100、200、500、1 000 ng·mL-1的标准工作溶液，0.22 μm PTFE滤膜过滤，待测。

1.4.3 仪器条件

色谱条件：流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈，梯度洗脱程序为0～2.0 min，10% B；2.0～2.1 min，10%～50% B；2.1～3.5 min，50% B；3.5～3.6 min，50%～90% B；3.6～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min，90%～10% B；4.1～4.5 min，10% B。柱温30 ℃，流速0.3 mL·min-1，进样体积10.0 μL。质谱仪条件：可加热电喷雾离子源（HESI），喷雾电压为3 500 V，毛细管温度为350 ℃，离子传输管温度为350 ℃，平行反应监测（PRM）模式，负离子模式，鞘气（N2）为705 psi，辅助气（N2）为202 psi，二级扫描分辨率为17 500，二级质谱归一化碰撞能（NCE）为20%、40%、60%。

5种核苷酸质谱图见图1，核苷酸定性监测离子对参数见表2。

1.4.4 方法学验证

以标准工作液的色谱峰面积（）对质量浓度（，ng·mL-1）进行线性回归。在信噪比（S/N）3和10条件下分别计算出5种核苷酸的定性检出限（Limit of detection，LOD）和定量检出限（Limit of quantitation，LOQ）。

稳定性试验：取已知浓度的AMP标准溶液，室温放置12 h和24 h，按1.4.3章节仪器条件测定AMP峰面积，计算其含量及相对标准偏差（RSD，%），n=6。

图1 5种核苷酸的质谱图

表2 5种核苷酸定性定量分析质谱数据

精密度试验：使用100 ng·mL-1混合标准待测液，按1.4.3章节仪器条件测定CMP、UMP、AMP、IMP、GMP峰面积，分别计算含量及相对标准偏差（RSD，%），平行测定6次。日内精密度在1 d内测定6次，计算RSD；日间精密度为3 d内测定6次，计算RSD。

加标回收：取1 mg·mL-1的5种核苷酸的标准储备液，添加适量体积纯水稀释成质量浓度为100 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1标准工作溶液。吸取1 mL标准工作液于样品中，按1.4.1章节步骤制备成加标样品溶液，并测定核苷酸含量。

1.5 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 线性范围与检出限

表3所示为5种核苷酸的线性回归方程及线性范围等相关信息。CMP、UMP、AMP、IMP、GMP在50～1 000 ng·mL-1范围内具有良好的线性，相关系数（2）达0.99以上，方法检出限分别为1.43、1.32、1.41、1.47、0.87 μg·g-1，定量限分别为4.28、3.97、4.23、4.41、2.62 μg·g-1。结果表明，该方法具有足够的灵敏度，能够满足测试要求，可以用于定量和定性分析。

2.1.2 稳定性与精密度试验

稳定性试验结果显示，AMP在12 h测得RSD为3.66%，放置24 h之后RSD为3.72%，表明溶液在室温条件下24 h保持稳定状态。

精密度试验结果显示（表4），日内精密度和日间精密度的RSD分别为2.17%～4.17%和2.95%～4.47%，均小于10%，说明该方法稳定，精密度高，能够满足测试要求。

2.1.3 回收率试验

测试样品中不含有IMP和GMP，其余3种核苷酸均能检测到。在样品中分别添加低质量浓度（100 ng·mL-1）和高质量浓度（1 000 ng·mL-1）的标准溶液，加标回收率为72.89%～91.98%，RSD为0.56%～9.31%（表5），表明该方法存在一定的基质效应，茶叶中干扰物质较多。Zhao等[23]对白茶中核苷酸的研究发现，使用亲水性正相色谱-高分辨质谱分析白茶萎凋过程中核苷酸，基质效应十分明显，其中UMP和IMP回收率较低，分别为31.0%～40.4%和38.8%～62.7%，GMP、CMP、AMP情况略好，分别为71.3%～74.1%、61.4%～71.9%和78.5%～ 86.2%。因此，相较于文献方法，本研究建立的方法，通过先水浴后超声波的复合提取方式，可以提高各种核苷酸的回收率。

2.2 铁观音做青过程中核苷酸变化

如图2所示，IMP、GMP是鲜度较强的核苷酸，但在铁观音品种的做青过程中未能检测到。做青阶段，AMP、CMP和UMP组分间含量差异显著，含量高低依次为UMP、CMP、AMP，其中UMP含量在16.98～26.78 μg·g-1，CMP含量在14.31～19.97 μg·g-1，AMP含量在7.80～9.91 μg·g-1。做青阶段，AMP含量呈现波动性变化；CMP的含量变化可以分为2个阶段，在一摇、一晾、二摇阶段保持稳定，二晾、三摇、三晾阶段增加，2个阶段间含量差异显著，阶段内含量差异不显著；UMP含量在三摇阶段显著增加，然后又恢复到初始水平，其余各阶段变化不显著，这说明UMP在做青阶段的合成和分解处于动态平衡，含量没有发生明显变化。在铁观音做青过程中，呈味核苷酸总量范围为40.78～56.69 μg·g-1，呈现动态平衡状态（表6），除了三摇阶段UMP的波动造成游离核苷酸总量增加之外，其余各阶段差异不显著。

表3 5种核苷酸的线性关系、线性方程及相关系数

注：表中表示峰面积，代表标准品质量浓度（ng·mL-1）

Note:represents the peak area andrepresents the mass concentration (ng·mL-1) of standard substances

表4 日内精密度与日间精密度（n=6）

表5 铁观音中5种核苷酸的加标回收率（n=3）

注：ND表示未检出

Note: ND indicates not detectable

植物中核苷酸含量会随着环境的改变在短时间内发生剧烈变化[24]。磷酸核糖基转移酶催化碱基与磷酸核糖生成核苷酸[25]，离体植物的游离态5'-核苷酸被组织中广泛存在的磷酸酶分解而导致含量下降[22]，具有生物活性的植物组织同时存在核苷酸的合成与分解代谢。在铁观音做青过程中，叶片细胞仍存在生物活性，除了CMP在做青后期增加外，AMP、UMP呈现为动态平衡状态。核苷酸的变化趋势有所不同，可能是底物浓度不同，导致反应速率差异；也可能是催化反应的酶活性、反应速率不同，导致核苷酸含量存在差异[26]。做青前期，由于各时间节点的间隔太短，这种差异性无法显现。做青后期，组织水分减少，相关酶活性降低，核苷酸变化更明显。

注：不同小写字母表示不同做青工序的同一核苷酸在P<0.05水平差异显著

表6 不同做青阶段铁观音呈味核苷酸总量

注：同一列不同字母代表数值间存在显著差异（＜0.05）

Note: Different letters in the same column mean significant differences (<0.05)

3 讨论

目前，暂未有使用反相液相色谱串联高分辨质谱对茶叶中游离态呈味核苷酸进行定量分析的相关报道。本研究首次建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定茶叶中游离态呈味核苷酸，该方法能够在4 min内快速、便捷地测定游离态呈味核苷酸的含量，精密度（RSD＜5%）、检出限（0.87～ 1.47 μg·g-1）、定量限（2.62～4.41 μg·g-1）和回收率（72.89%～91.98%）均呈现良好结果，可用于茶叶中呈味核苷酸的定性和定量分析。植物复杂的代谢产物使得微量核苷酸的提取和分析变得十分复杂[27]。Baccolini等[28]和Dietmair等[29]研究表明，快速沸水浸提法仅适用于提取核苷，不适用于提取核苷酸。本研究采用先沸水后超声波各浸提10 min的复合提取方法，将亲水色谱改为反相色谱，虽然不同核苷酸的分离度相对差一些，但是对于高分辨质谱PRM模式，分离度差并不影响相关物质的定性定量分析。复合提取方式提高了目标化合物的提取效率，方法整体回收率相较于Zhao等[23]的方法有较大提高，从31.0%～86.0%提高至72.89%～91.98%。

食品领域对呈味核苷酸及其衍生物的研究较多[30-32]，乌龙茶呈味核苷酸的研究较少。成品茶呈味核苷酸的组成和含量存在茶类和品种差异。绿茶以AMP、UMP为主，红茶以CMP、GMP、UMP为主[33]。黑茶中AMP含量随茶树品种不同差异显著[34-35]。本研究发现乌龙茶呈味核苷酸以UMP、CMP、AMP为主。

已有研究表明，呈味核苷酸有类味精的协同作用，可提高茶叶鲜味[33]。AMP、IMP、GMP的滋味阈值分别为500、250、125 ng·mL-1[36]，尚未知CMP和UMP的滋味阈值。风味阈值越低，说明其敏感度越高，鲜味贡献度依次排序为GMP＞IMP＞AMP。本研究检测出铁观音做青过程中AMP平均值为9.10 μg·g-1，按照1∶50茶水比计算，AMP的滋味活性值（TAV）为0.36，小于1，对鲜味没有直接贡献。铁观音做青阶段尚未积累游离态IMP和GMP，无法通过TAV值推算5'-呈味核苷酸对铁观音的鲜味贡献度。

茶叶鲜味的加工学研究侧重于游离氨基酸[37]，对呈味核苷酸相关研究相对滞后。茶树鲜叶中腺嘌呤核苷酸含量最高，尿嘧啶核苷酸次之，鸟嘌呤核苷酸含量最低[33]；鲜叶不含有IMP，部分品种的AMP在脱氨酶催化下脱去氨基生成IMP[38]。

5'-核苷酸在加工中整体表现为减少或发生结构修饰。白茶、绿茶、红茶的核苷酸组成规律因加工工艺不同而有所差异。白茶萎凋过程，可检出2种5'-呈味核苷酸AMP与GMP，分别在萎凋30 h和6 h后减少[23]；也有研究认为，白茶萎凋过程中，可检测到AMP、IMP、UMP、黄苷酸（XMP），仅UMP下降[39]。绿茶和红茶加工过程中，核苷酸含量减少；绿茶的5'-呈味核苷酸含量整体高于红茶，组成上AMP＞UMP＞CMP[38]。林家正[40]研究发现，红光萎凋后期，腺嘌呤、腺苷和腺苷-3'-单磷酸含量显著上升。本研究从乌龙茶中鉴定出3种5'-呈味核苷酸，含量依次为UMP＞CMP＞AMP，与鲜叶及绿茶的分布规律不一致，表明做青促进了乌龙茶化学组成的变化，且与其他茶类加工过程中的化学变化存在差异。

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Determination of Flavored Nucleotides in Oolong Tea by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry and Changes of Flavored Nucleotides in the Making Green Process of ‘Tieguanyin’ Tea

HUANG Yan1,2, ZHOU Xiaosen1,3, GAO Chenxi2, ZHANG Lingzhi2, RONG Jiefeng4*, SUN Weijiang2*

1. Anxi College of Tea Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 2. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 4. Quanzhou Customs Comprehensive Technology Service Center, Quanzhou 362000, China

Nucleotide is a kind of important substrate for the biosynthesis of nucleic acid and caffeine in tea, which is also one of the most important umami substances in tea infusion. Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry was used for the determination of nucleotide contents. Five types of flavored nucleotides including cytidine 5'-monophosphate (CMP), uridine 5'-monophosphate (UMP), adenosine 5'-monophosphate (AMP), inosine 5'-monophosphate (IMP) and guanosine 5'-monophosphate (GMP) in tea were determined within 4 min, and dynamic changes of the above nucleotide contents in the making green process of ‘Tieguanyin’ Oolong tea were analyzed. The results show that the detection limits of the five nucleotides were 0.87-1.47 μg·g-1, with the limits of quantification of 2.62-4.41 μg·g-1and a linear range of 50-1 000 ng·mL-1. The intra-day and inter-day precisions were 2.17%-4.17% and 2.95%-4.74%, with a recovery rate of 72.89%-91.98%. Three types of nucleotides, AMP, CMP and UMP, were detected in tea cultivar ‘Tieguanyin’, with the UMP content of 16.98-26.78 μg·g-1, the CMP content of 14.31-17.56 μg·g-1, and the AMP content of 7.80-9.91 μg·g-1. The UMP, CMP, and AMP in ‘Tieguanyin’ were ranked in order from high to low and the CMP content increased slowly in late stages of making green process. The total amount of flavored nucleotides in the making green process varied from 40.78 to 56.69 μg·g-1, showing the trend of mild and stable fluctuation. The method is rapid, accurate and sensitive with high stability and precision, which can be used as an analytical technique for the study of flavor chemistry in tea processing.

Tieguanyin, umami taste, making green, flavored nucleotide

S571.1

A

1000-369X(2023)02-227-10

2022-11-24

2023-01-23

福建省自然科学基金（2019J01413）

黄艳，女，讲师，主要从事茶叶加工与品质研究。*通信作者：jfrong2010@163.com；swj8103@126.com