超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其4种前体化合物含量

邱世婷，侯雪*，雷绍荣，韩梅，贺光云，李莹，覃蜀迪

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其4种前体化合物含量

邱世婷1,2，侯雪1,2*，雷绍荣1,2，韩梅1,2，贺光云1,2，李莹1,2，覃蜀迪1,2

1. 四川省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，四川 成都 610066； 2. 农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（成都），四川 成都 610066

烟酰胺核糖体（NR）、烟酰胺单核苷酸（NMN）、烟酸（NA）和烟酰胺（NAM）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的4个前体化合物，口服后可在体内转化为NAD+发挥抗衰老等功效。建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定茶叶中NAD+及其4种前体化合物含量的方法，茶叶经水提取，稀释后直接进行UPLC-MS/MS分析。经方法学验证，5种目标化合物在各自范围内线性关系良好（2≥0.99），回收率为70.00%～120.00%，相对标准偏差为2.09%～14.50%，方法的定量限为0.10～0.50 μg·L-1。绿茶、红茶和黑茶中5种目标化合物的含量测定结果显示，绿茶和红茶是NR、NMN、NAD+的良好天然食物来源；主成分分析结果显示，根据5种化合物含量能对红茶、绿茶、黑茶进行良好的类群区分；聚类分析结果显示，同一产地同一类型茶叶中5种化合物质量分布不均，离散度较高，无法进行区分。

茶叶；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；烟酰胺单核苷酸；烟酰胺核糖体；超高效液相色谱-串联质谱

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+，辅酶Ⅰ）是一种参与人体各种生理过程的辅酶，在维持细胞生长、分化和能量代谢及细胞保护方面起着重要作用[1-2]。人体中NAD+水平会随着年龄增加而不断下降[3-4]，从而引起机体一系列生理机能衰退和退行性病变[5-6]，如何恢复衰老机体内正常NAD+水平，已成为目前研究的热点。由于NAD+分子过大，直接口服很难穿过细胞膜进入体内[7]，口服其前体化合物是提升体内NAD+水平的手段之一。烟酰胺（Nicotinamide，NAM）和烟酸（Nicotinic acid，NA）两种化合物被认为是合成NAD+的两个膳食前体[8]，但两者大剂量使用对人体均存在副作用，如烟酸易引起人体面部潮红，烟酰胺会引起肝脏毒性等[9-10]。后续研究发现，烟酰胺的核糖化形式烟酰胺核糖体（Nicotinamide riboside，NR）及NR的磷酸化形式烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）也是NAD+合成的重要细胞外前体化合物[11-12]。NMN是NAD+最直接高效的前体物质，NR功效虽仅有NMN的1/150[7]，但已有多项研究证明体外补充NMN或NR可显著增加动物体细胞内NAD+含量[13]，发挥抗衰老、增强细胞活力、减弱认知退化等作用[14-17]，同时对人体无毒副作用[18]。Mills等[14]研究发现，当NMN给药含量为100 mg·kg-1·d-1时，能够减轻小鼠大多数与年龄相关的生理衰退疾病，而人类的等效表面积剂量为8 mg·kg-1·d-1。Yoshino等[17]汇总了NAD+的两个中间体预防和治疗与年龄相关的生理衰退和疾病的相关实例，发现NAD+中间体与哺乳动物衰老和长寿控制机理有关。NMN和NR逐渐成为医药保健等领域研究的热点，具有广阔的应用前景。

目前NMN和NR在日本和美国已作为营养补充剂的原料进入抗衰老领域市场，价格十分昂贵[19]。但在我国NMN和NR尚未取得相关许可，膳食摄入仍是其主要获取途径，寻找NMN和NR良好的天然食物来源也受到了研究者的关注[20]。NMN、NR、NAM和NAD+已被报道存在于多种天然食物来源中，NR目前仅有乳品中的含量报道，具体情况见表1。

茶叶具有抗衰延老[22]和改善心血管疾病等一系列特殊保健功能[23]，这些功效与NAD+及其4个前体化合物的功能具有较大的相似性。NAD+及其4个前体化合物极性大，难挥发，易溶于水，难溶于有机溶剂[20,24-25]，目前已报道的定量方法有液相色谱-紫外法[25-26]、液相色谱-质谱法[7,19-20,24]、酶联免疫法[8]等，主要集中在生物组织、细胞、蔬菜和水果[27]等基质中，且多为单一化合物含量测定，未见茶叶中NAD+及其4个前体化合物含量同时测定方法研究报道。

基于茶叶中NAD+及其4个前体化合物物质微量存在，且茶叶基质复杂，干扰性强，本研究以灵敏度高，抗干扰能力强的超高效液相色谱-串联质谱仪为分析仪器，通过优化样品前处理方法和色谱条件，以绿茶、红茶和黑茶为研究对象，建立同时快速测定茶叶中NAD+及其4个前体化合物的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），测定绿茶、红茶和黑茶中NAD+及其4个前体化合物的含量，并运用主成分分析等比较不同类型茶叶、不同产地茶叶中5种目标化合物的成分差异，以期为茶叶营养功效成分揭示和大健康产品研发提供参考。

表1 5种化合物在天然食物中的含量

注：“—”表示未查询到相关数据，ND表示未检出

Note: “—” indicates that no relevant data has been queried, ND indicates not detected

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

104个供试茶叶样品取自四川省主要茶叶生产基地和合作社，包含75个绿茶（绵阳市21个、泸州市27个、雅安市27个），14个红茶（绵阳市5个、泸州市3个、雅安市6个），15个黑茶（雅安市），均为2022年上半年生产。

NMN（纯度≥95%）购自美国Sigma-Aldrich公司，NR（纯度95.8%）和NAD+（纯度92.5%）购自上海安谱璀世标准技术服务有限公司，NA（纯度99.9%）和NAM标准品（纯度99.9%）购自广州佳途科技股份有限公司，超纯水（实验室一级水）由Milli-Q超纯水机制备，乙腈（色谱纯）和甲醇（色谱纯）购自美国Fisher Scientific公司，甲酸（色谱纯）购自德国CNW公司。

1.2 仪器与设备

LC-MS 8060超高效液相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司；Multi Reax多位试管涡旋振荡器，德国海道夫公司；JY2002电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Neofuge 18R台式高速冷冻离心机，上海力康仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Waters anionic polar pesticide色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），柱温为50 ℃，流速为0.5 mL·min-1，进样量为10 μL；流动相A为0.9%甲酸水溶液，流动相B为0.9%甲酸-乙腈。梯度洗脱程序：0～4 min，0%～15% B；4～7 min，15% B；7～8 min，15%～90% B；8～12 min，90% B。

表2 5种化合物的质谱参数

注：*为定量离子

Note:*Quantitative ion

1.3.2 质谱条件

质谱离子源为电喷雾电离（Electron spray ionization，ESI）源，接口电压为4 000 V，多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式，雾化气流速为3 L·min-1，干燥气流速为10 L·min-1，加热气流速为10 L·min-1，接口温度为300 ℃，脱溶剂管温度为250 ℃，加热模块温度为400 ℃。其他质谱参数如表2所示。

1.3.3 样品前处理

称取0.25 g粉碎的茶叶样品，置于50 mL离心管中，加入25 mL水提取，涡旋振荡40 min，8 000 r·min-1离心5 min，取10 μL上清液用乙腈稀释至1 mL，过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

1.4 数据处理

采用OriginPro 2021、SIMCA 14.1软件进行数据统计分析和绘图；采用SPSSAU软件进行ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

将5种化合物单独配制成1 mg·L-1的标准溶液，进行一级质谱全扫描，经扫描发现，5种化合物的母离子峰均为[M+H]+峰，将其作为母离子，利用仪器自带自动优化程序，进行子离子扫描，优化碰撞电压（CE）、Q1偏差（V）、Q3偏差（V）等参数，在MRM模式下选取响应高、离子比稳定的离子作为子离子，最终形成的MRM扫描参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

5种化合物属于亲水性化合物，极性大，故5种化合物在传统的反相色谱柱中基本无保留[24]，参照文献[25]条件，选用C18反相色谱柱，5种化合物出峰时间在3 min以内（图1A），且NAD+灵敏度低。利用5种化合物高亲水性和强极性特点，本研究选择Waters Anionic Polar Pesticide阴离子交换柱，其固定相由具有三键键合二乙胺（Diethylamine，DEA）键合相的亚乙基桥杂化（Bridge ethylidene hybrid，BEH）颗粒组成，兼具亲水性表面和阴离子交换特性，适合用于保留和分离极性阴离子化合物。5种目标化合物均含有羧酸或膦酸基团，在弱酸性溶液中带负电，通过阴离子交换作用可实现色谱分离，因此流动相中需加入0.9%甲酸调节流动相pH值，在此酸性条件下5种化合物分离效果和峰形均较好（图1B），加入甲酸铵后NR峰形拖尾，灵敏度降低。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

已有研究报道[19,27]，不同浓度甲醇提取液对食品原料中NMN含量测定有一定影响，本研究考察了水、5%、10%、20%、30%、40%、50%甲醇水溶液对3种茶叶中5种化合物提取效果，平行6次。由图2可知，3种茶叶中NMN和NAD+峰面积随提取溶剂中甲醇含量的增加而降低，NR峰面积随提取溶剂中甲醇含量的增加而增加，NA和NAM峰面积基本不受提取溶剂中甲醇含量的影响。由于NR含量较低，考虑提取溶剂的环保型和茶叶日常饮用习惯，最终本研究选取水为提取溶剂。

2.3.2 提取温度的选择

分析了提取温度为常温（约20 ℃）、50 ℃、80 ℃时对3种茶叶中5种化合物的提取效果。测定了不同温度下目标化合物的峰面积，平行6次，利用单因素方差分析研究温度对于目标化合物提取效果的差异性。从表3可以看出，不同温度对于NMN、NAD+、NR提取有显著性差异（<0.05），而对NAM和NA无显著性差异（>0.05）。通过峰面积比较，可见茶叶中NMN和NAD+峰面积随提取温度升高而下降，NR峰面积随提取温度升高而升高，最终本研究选择常温为提取温度。

2.3.3 提取时间的选择

以绿茶为例，比较分析提取时间为5、10、20、30、40、50、60 min时，5种目标化合物的提取峰面积。从表4可以看出，不同提取时间对于NR、NAM、NMN提取有显著性差异（<0.05），而对NA和NAD+无显著性差异（>0.05）。通过峰面积比较可知，NR、NAM和NMN提取时间为40 min时峰面积达到平衡，40 min后继续增加提取时间，峰面积增加不明显，故本研究选择提取时间为40 min。

注：A为C18柱，B为Waters Anionic Polar Pesticide柱（1-NR；2-NA；3-NAM；4-NMN；5-NAD+）

图2 不同提取溶剂对3种茶叶中目标化合物的提取效果比较

表3 不同提取温度方差分析结果（n=6）

注：ND表示未检出，*<0.05，**<0.01。下同

Note: ND indicates not detected. *<0.05, **<0.01. The same below

2.3.4 去除茶叶基质效应方法的选择

茶叶基质在液质串联色谱中通常表现出非常强的基质效应，常见的去除基质效应的方法有同位素标记、基质标准溶液、稀释补偿等[28]。由于茶叶中含有目标化合物，无法取得空白基质，且目前缺乏同位素标记标准物质，故本研究首先选择稀释补偿法去除基质效应，将提取后的母液用乙腈溶剂稀释100倍后获得基质稀释液。分别采用乙腈和基质稀释液配制相同浓度的标准溶液，上机考察基质效应，基质效应（ME）的计算公式如下：

=[(－ck)/－1]×100%

其中，为基质效应值，为目标物在基质中的峰面积，ck为目标物在基质空白中的峰面积，为目标物在溶剂中的峰面积。强基质效应：＞50%或＜–50%；中基质效应：–50%≤≤–20%或50%≤≤20%；弱基质效应：–20%＜＜20%[29]。不同茶类对不同目标化合物的基质效应不同（表5），选择稀释补偿后，NR由于出峰时间早，受基质影响大，仍为强基质效应，为补偿基质效应对NR的影响，本研究采用黑茶作为空白基质配备标准溶液曲线对NR进行定量校准（黑茶中NR为未检出）；其余4种化合物采用稀释补偿法后基质效应均为弱基质效应，且无法获得此4种化合物的空白基质，故NAM、NA、NMN、NAD+采用试剂标样外标曲线法进行校准。

2.4 线性范围、方法检出限和定量限

按照仪器信噪比（S/N）为3计算方法检出限，以仪器信噪比（S/N）为10计算方法定量限，方法检出限为0.05～0.10 μg·L-1；定量限为0.10～0.50 μg·L-1。NR标准品用黑茶基质稀释液配制成0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg·L-1标准上机溶液，NAM、NA、NMN、NAD+用乙腈分别配制为0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg·L-1标准上机溶液，以5种化合物峰面积（）为纵坐标，相应的质量浓度（，μg·L-1）为横坐标，计算线性方程，结果见表6。NA在0.5～50 μg·L-1线性关系良好，其余4种化合物在0.1～50 μg·L-1线性关系良好，相关系数均大于0.99。

2.5 回收率与精密度

以绿茶、红茶和黑茶为基质，在接近基质本底浓度1～10倍的浓度水平下进行了添加回收率试验，设计了高低两个添加浓度，每个样品平行测定6次，由表7可知，5种化合物回收率在70.00%～120.00%，相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）为2.09%～14.50%。

2.6 溶液稳定性试验

取对照溶液、绿茶供试溶液分别在制备好后0、2、6、12、18、24 h进样测定各目标化合物的峰面积，5种化合物的峰面积RSD范围为3.51%～8.18%，说明以上溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 实际样品含量测定

应用该方法对四川省泸州市、雅安市和绵阳市3个产地采集的104个茶叶样品进行含量测定，结果显示（表8），不同种类的茶叶5种化合物含量差异明显，绿茶中NAD+含量最高，红茶中NMN含量最高，绿茶和红茶中NR含量差异不大，黑茶中NR、NMN和NAD+含量最低。说明茶叶中的NMN、NAD+、NR含量差异可能与茶叶品种、采摘时期、加工工艺和贮存时间等因素密切相关。

表4 不同提取时间方差分析结果（绿茶，n=6）

表5 5种化合物在绿茶、红茶和黑茶中的基质效应

表6 5种化合物的线性关系、检出限和定量限

注：*采用黑茶基质配制标准曲线

Note: * The standard curve was prepared by dark tea matrix

表7 5种化合物的加标回收率、相对标准偏差（n=6）

注：BC表示本底浓度，LCA表示低浓度添加，PD表示实际测定值，AR表示平均回收率，RSD表示相对标准偏差，HCA表示高浓度添加

Note: BC represents the background concentration. LCA represents low concentration addition. PD represents the practical determination value. AR represents average recovery. RSD represents relative standard deviation. HCA represents high concentration addition

每100 g绿茶和每100 g红茶中NMN含量分别为(0.30±0.19) mg、(0.99±0.33) mg，高于已报道的部分蔬菜和海产品中NMN含量[14]，且每100 g绿茶和每100 g红茶中NAD+含量分别为(8.76±2.99) mg、(4.45±2.23) mg，高出已报道的铁皮石斛（鲜品）中NAD+的含量[7]。绿茶和红茶中均有NR检出，而黑茶中未检出，目前仅有牛奶中也有检出微量NR报道[8]，故无法进行比较。可见，绿茶和红茶是补充NR、NMN、NAD+的良好食物来源。

2.8 正交偏最小二乘判别分析

为更好地比较3种茶叶样品的组间差异，以茶叶中5种目标化合物含量为变量，导入SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。结果显示，该5种化合物含量能对红茶、绿茶、黑茶进行良好的类群区分（图3A），其中2为0.946，2为0.883，2为0.865（2和2分别表示所建模型对和矩阵的解释率，通过交叉验证计算得出的2则用以评价模型的预测能力[30]）。同时比较75个绿茶产地的组间差异（图3B），模型效果欠佳，基本无法对产地进行区分。同一类型茶叶不同产地含量差异说明茶叶生长环境也能影响茶叶中NAD+及其4种前体化合物含量。

2.9 聚类分析

采用SIMCA 14.1软件，以茶叶中5种目标化合物含量为变量，采用组间联接方法对73个来自不同产地的绿茶进行聚类分析，结果如图4所示。样品间判别距离越小，说明样品相似度越高。泸州、雅安和绵阳三地绿茶样品仅部分相邻，大部分相隔较远，各地整体相似度较低，5种化合物含量分布不稳定，无明显地域规律。综合聚类分析结果发现，聚类分布与主成分分析结果相互印证，说明两种分析分类结果可靠。

3 结论

本研究首次建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中NAD+及其4种前体化合物含量方法，该法前处理简单、检测快速、准确度高、干扰少。通过测定首次报道了茶叶中NAD+及其4种前体化合物的含量，这可能是茶叶抗衰延老功效的物质基础。通过建立的检测方法可简便快速追踪茶叶生长、加工、储存过程中NMN、NR和NAD+的含量变化，为不同茶叶进一步资源开发及大健康产品研发提供更加全面的技术支持。

表8 每100 g绿茶、红茶、黑茶中5种化合物含量

图3 不同类型（A）和不同产地（B）茶叶主成分分析图

图4 不同产地绿茶中5种成分含量聚类图

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Simultaneous Determination of Nicotinamide Adenine Dinucleotide and Its Four Precursors in Tea by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QIU Shiting1,2, HOU Xue1,2*, LEI Shaorong1,2, HAN Mei1,2, HE Guangyun1,2, LI Ying1,2, QIN Shudi1,2

1. Institute of Quality Standard and Testing Technology Research, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China; 2. Laboratory of Risk Assessment for Agricultural Product (Chengdu), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chengdu 610066, China

Nicotinamide ribosome (NR), nicotinamide mononucleotide (NMN), nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NAM) are 4 precursor compounds of NAD+, which can be converted to NAD+to work after oral administration. This study established a method for simultaneous determination of NAD+and its four precursors in tea by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The tea samples were extracted by water, then diluted and directly analyzed by UPLC-MS/MS. Method validation shows this method has good linearity in their respective range with correlation coefficients (2) higher than 0.99. The average recoveries ranged from 70.00 % to 120.00% with relative standard deviations (RSDs) of 2.09%-14.50%. The limits of quantitation (LOQs) were 0.10-0.50 μg·L-1. The determination results of five target compounds in green tea, black tea and dark tea show that green tea and black tea were the good natural food sources of NR, NMN, NAD+. The results of principal component analysis show that the contents of five compounds could well distinguish black tea, green tea and dark tea. The cluster analysis shows the same type of tea from the same origin was of uneven quality, with high dispersion in samples, and it was difficult to identify each other.

tea, nicotinamideadenine dinucleotide (NAD+), nicotinamide nononucleotide (NMN), nicotinamide riboside (NR), UPLC-MS/MS

S571.1；O657

A

1000-369X(2023)02-216-11

2023-01-04

2023-03-03

国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP20220207）

邱世婷，女，硕士研究生，研究方向为农产品质量安全与营养。*通信作者：houxue127@163.com