咳露口服液指纹图谱的建立及6种成分的含量测定

贺敬霞,许 刚,党艳妮,王晓梅,张 鑫,王 青,刘 峰*

1.陕西国际商贸学院, 咸阳 712042;2.陕西步长制药有限公司, 西安 710075

咳露口服液是由陕西步长制药有限公司研制的中药大品种复方制剂,由黄芩、川贝母、枇杷叶、紫菀、甘草等8种中药制成,具有化痰、止咳、平喘等功效,临床效果良好,可用于治疗支气管肺炎、细菌性肺炎等引起的咳嗽、咳痰等[1-3]。其不良反应小,安全性高,有效治愈率达98%[4]。既可发挥中枢神经性止咳作用,又可发挥外周神经性止咳作用。双管齐下,双效止咳。同时其含有多种成分,可作用于咳嗽反射各个环节,多管齐下,多点作用,使止咳排痰作用更加全面[5]。咳露口服液作为中药复方,药效物质基础研究是中医药现代化研究的关键领域,是决定中药安全性、有效性和质量控制的基础。但中药复方的复杂性和多样性是中药现代化研究的难点。鉴于此,关于化学组分,研究者提出多种中药复方物质基础研究理论,如“组分结构”理论、“基于成分敲除/敲入的中药药效物质辨识与质量控制模式”的研究理论、“等效成分群”理论[6-7]。这些理论的建立都需要进行基础组分研究。同时指纹图谱的建立是中药药效物质基础研究中质量控制的重要方法之一。指纹图谱结合多成分定量分析的中药质量控制新模式,解决了从整体上全面控制中药质量的方法学问题。故进行咳露口服液基本物质基础研究,并建立指纹图谱方法,确保药物安全有效,质量可控。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters H-class超高效液相色谱仪(美国Waters公司);KUDOU超声仪(上海科导超声仪器有限公司);MS430TS电子天平和XPE205电子天平均购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司;Merck Milli-Q纯水仪(默克化工技术上海有限公司)。

1.2 试药

甲醇、乙腈[GR,塞默飞世尔科技(中国)有限公司];甲醇(AR,国家化学集团化学试剂有限公司)、磷酸(AR,天津市河东区红岩试剂厂)。

汉黄芩苷(批号MUST-20111601,质量分数≥99.06%),甘草酸铵(批号MUST-21061007,质量分数≥99.06%),异甘草苷(批号MUST-21051501,质量分数≥99.31%),均购自成都曼斯特生物科技有限公司;芹糖异甘草苷(批号PS012516,质量分数≥98.5%,成都普思生物科技有限公司);黄芩苷(批号110715-201720,质量分数≥93.5%),黄芩素(批号1115-201720,质量分数≥98.5%),均购自中国食品药品检定研究院;咳露口服液(规格:180 mL·瓶-1,陕西步长制药有限公司)。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1色谱条件 色谱柱为Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)。梯度洗脱条件为0～5 min,2%～5%A;5～10 min,5%～10%A;10～15 min,10%～13%A;15～20 min,13%～20%A;20～35 min,20%～30%A;35～45 min,30%～40%A;45～50 min,40%～20%A;50～55 min,20%～2%A。柱温为常温;流速为0.2 mL·min-1;进样量为1 μL;检测波长为354、250 nm。

2.1.2对照品溶液的制备 精密称定芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵对照品适量,加甲醇稀释并定容至刻度,超声助溶。配制质量浓度分别为311 、369.433、1 122、541.858、780.120、886.587 μg·mL-1的对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 取咳露口服液1 mL,置于5、50 mL量瓶中,加水稀释并定容至刻度,摇匀,过0.22 μm滤膜,取续滤液,备用。

2.1.4方法学验证

2.1.4.1精密度考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次,以13号峰(黄芩苷)为参照,测得共有峰保留时间RSD值为0.02%,共有峰相对峰面积的RSD值为0.67%～1.35%。表明仪器精密度良好。

2.1.4.2稳定性考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件于 0、2、4、6、8、10、12、24 h进样,以13号峰(黄芩苷)为参照,测得共有峰保留时间RSD值为0.19%～0.26%,共有峰相对峰面积的RSD值为0.27%～2.27%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.4.3重复性考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3项下方法平行制备6份供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件进样,以13号峰(黄芩苷)为参照,测得共有峰保留时间RSD值为0.13%～0.4%,共有峰相对峰面积的RSD值为1.07%～2.20%。表明方法重复性良好。

2.1.5不同批次指纹图谱考察 按照2.1.3项下方法制备10批次样品稀释溶液,按照2.1.1项下色谱条件进样分析。导入“2012版中药指纹图谱相似度评价系统”,以S1为参照图谱,用平均数时间窗宽度为0.1 min生成对照指纹图谱,进行不同批次色谱图进行自动匹配。结果详见图1、图2。由图1可知,在250 nm处指认出25个色谱峰。其中13号峰为黄芩苷、19号峰为汉黄芩苷、21号峰为黄芩素、23号峰为甘草酸铵。由图2可知,在354 nm处指认出19个色谱峰。11号峰为芹糖异甘草苷、12号峰为异甘草苷、13号峰为黄芩苷、17号峰为汉黄芩苷、19号峰为甘草酸铵。样品相似度结果见表1。由表1可知,以S1为参照色谱,在354 nm处各批次样品间的相似度为0.991～1.000,同时在250 nm处各批次样品相似度为0.990～1.000,均符合指纹图谱质量控制规定[8]。表明咳露口服液质量稳定,建立的UPLC法适用于咳露口服液的质量评价与控制。

注:13.黄芩苷;19.汉黄芩苷;21.黄芩素;23.甘草酸铵。

注:11.芹糖异苷草苷;12.异甘草苷;13.黄芩苷;17.汉黄芩苷;19.甘草酸铵。

2.2 含量测定

色谱条件同2.1.1项下条件,检测波长。芹糖异甘草苷、异甘草苷为354 nm,黄芩苷、汉黄芩苷、甘草素、甘草酸铵为250 nm。色谱图见图3。

注:1.芹糖异甘草苷;2.异甘草苷;3.黄芩苷;4.汉黄芩苷;5.黄芩素;6.甘草酸铵。

2.2.1方法学验证

2.2.1.1标准曲线的制备 分别精密吸取各对照品溶液适量,置于量瓶中,加甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,得系列线性对照品溶液,按照2.1.1项下色谱条件进样,以峰面积y为纵坐标、质量浓度x(μg·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,结果见表2。

表2 6种指标成分的标准曲线及线性范围

2.2.1.2精密度考察 精密吸取各对照品适量,混合,按照2.1.1项下色谱条件,连续进样6次,计算芹糖异甘草苷、黄芩苷、异甘草苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、黄芩素6种成分峰面积的RSD值分别为0.90%、0.73%、1.25%、0.67%、1.35%、1.10%。表明仪器精密度良好。

2.2.1.3稳定性考察 取咳露口服液(批号210226),按照2.1.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件,分别于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样,测定芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵峰面积,计算得样品溶液RSD值分别为0.54%、1.31%、0.63%、0.71%、2.64%、1.52%,均小于3%,表明样品溶液24 h内稳定性较好。

2.2.1.4重复性考察 称取同一批次(批号210226)咳露口服液,按照2.1.3项下方法平行制备6份供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件测定,依次测得6种成分峰面积,得RSD值分别为2.06%、2.48%、2.33%、2.56%、2.40%、2.29%,均小于3%,该方法重复性良好。

2.2.1.5加样回收率考察 取同一批已知含量的咳露口服液(批号210226)2.5 mL 6份,分别精密加入各对照品溶液,按照2.1.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件测定,计算加样回收率,测得各对照品的平均加样回收率范围为98%～103%,其RSD(n=6)<3%,详见表3,说明该方法准确度良好。

表3 对照品加样回收率实验结果

2.2.2不同批次咳露口服液含量测定 按照2.1.3项下方法制备10批次样品溶液,按照2.1.1项下色谱条件进样分析,并测定咳露口服液中6种成分含量。见表4。由表4可知,10批次咳露口服液各成分含量范围为芹糖异甘草苷25.057～29.65 μg·mL-1,异甘草苷26.404～32.072 μg·mL-1,黄芩苷824.457～1 291.929 μg·mL-1,汉黄芩苷319.541～557.251 μg·mL-1,黄芩素4.243～15.839 μg·mL-1,甘草酸铵250.566～479.037 μg·mL- 1。

表4 10批咳露口服液的含量测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件筛选

本实验分别对甲酸水、磷酸水及不同pH磷酸氢二钾流动相溶液进行筛选,甲酸水对比磷酸水,在相同条件下,色谱峰较磷酸水少,且峰形、分离度差。用磷酸氢二钾溶液,随着pH值的增大色谱峰分离较好,pH虽在C18色谱柱酸碱范围内,但柱效发生较大变化,且大大降低了色谱柱的使用寿命,通过对比最终选用磷酸水进行咳露口服液的分离研究。通过UPLC全波长扫描,各有效色谱峰在230、280、250、354 nm等波长处部分峰的灵敏度及吸收较好,为使该色谱方法更有效地进行指认峰的测定,综合考虑选用250、354 nm进行波长检测。同时在26 min前色谱图峰形较多,而目前咳露口服液已确定已知成分较少,后期可进一步进行咳露口服液的物质基础研究。

3.2 样品处理及含量测定

前期对咳露口服液进行24、48、72 h,体积分数为20%～80%乙醇的醇沉溶液考察,结果显示不同体积分数乙醇及醇沉时间对色谱峰的数量、含量及色谱柱柱效等未产生较大的变化,表明咳露口服液中含有的糖分较少,对色谱柱及有效成分结果影响较小[9]。同时通过10批次样品溶液的含量测定,在咳露口服液中,其成分含量最高为汉黄芩苷,其次为黄芩苷、甘草酸铵。本研究结果表明建立的指纹图谱方法稳定,建立的色谱方法可用于已指认出的成分含量测定。2种方法的结合可共同用于咳露口服液的质量控制。