以薰衣草为主的2 种精油主成分分析及其功效评价

刘菲，王文翠，徐悦，姚雷，韩婷婷，杨素珍

（1.山东福瑞达生物股份有限公司，山东 济南 250101；2.新疆伊帕尔汗香料股份有限公司，新疆 伊犁 835213；3.上海交通大学，上海 200240）

薰衣草精油（lavender oil)在中国主要产自新疆的伊犁，是当地特色经济作物薰衣草主要的加工产品，由于目前国内对薰衣草精油的加工利用较少，主要以出口为主，价格由国外市场所决定，种植的农民收益较低。如何提高薰衣草精油的开发利用价值，已成为保护我国特色经济作物在国际上占有地位亟待解决的问题。已有大量的研究表明，薰衣草精油具有一定的助眠作用。目前对失眠的干预主要采用药理干预和非药物干预[1]，而其中就有一些是采用精油来作为干预办法，于佳慧等[2]研究了复方宁神精油对失眠大鼠行为学及下丘脑GABA、GLU 含量的影响，结果表明该精油的高浓度组能明显缩短失眠大鼠睡眠潜伏期并延长睡眠持续时间，有效缓解失眠所致的紧张焦虑情绪；彭钟秀等[3]研究了2 种精油成分缓解大学生失眠与焦虑的效果，结果表明精油干预后，延长了总睡眠时间；罗坤垛[4]就中国苦水玫瑰的助眠功效进行了研究，苦水玫瑰精油显著提高了小鼠下丘脑、海马、纹状体的5-HT 等。Cooksley 等[5]综述了吸入薰衣草精油帮助睡眠的研究，其中吸入2%的薰衣草精油后对焦虑水平和睡眠质量都有所改善。但是，通过喜好度评估试验发现，大概有30%～40%的人不喜欢薰衣草精油的气味，这也就意味着薰衣草精油对这部分群体很难发挥助眠作用。

研究还发现，患有焦虑及相关障碍的人通常睡眠质量差，并表现出睡眠障碍，尤其是失眠[6]。而睡眠障碍又是焦虑及相关障碍的一个核心特征，说明不良睡眠和焦虑会引发恶性循环[1]。同时失眠重则会引起一系列疾病，如高血压、肥胖、糖尿病、肾病等，轻则影响日常工作与学习[7-10]。为了不降低白天的工作质量，大部分人选择用咖啡来提振精神和增强行为能力，咖啡中含有大量的咖啡因，咖啡因已经被证明确实可以改善睡眠不足后的神经行为功能，且效果≥21 h[11-13]。但是，很多人在摄入咖啡因以后，又会导致一系列的睡眠问题，包括总睡眠时间减少、入睡困难、夜间觉醒增加、白天嗜睡等[14-17]。而这些与睡眠相关的问题可能在失眠症患者中被放大[18]。基于此，本研究将焦虑与咖啡因2 个因素结合起来制造小鼠失眠模型，以探究该模型下精油的作用效果。

综上，针对上述试验模型，结合精油在失眠研究中表现出的优越效果，探究调配后以薰衣草为主的复方精油在焦虑和咖啡因协同导致失眠中的作用效果及对相关神经递质的影响，本研究调配了2 种相较于单一薰衣草精油接受度更高的复方精油用于试验，以期能扩大薰衣草精油的产品加工范围，增加其商业价值。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康BALB/c 小鼠，雌性，6～8 周龄，体质量18～22 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠分笼饲养于上海交通大学实验动物中心，每笼6 只，实行自由摄食和饮水，24 h 给予适宜照明，环境温度控制在（25±1）℃，相对湿度保持在（60±10）%，在进行正式试验前，所有小鼠均适应性饲养1 周。试验经上海交通大学实验动物机构伦理委员会批准，批准号为A2021019。

1.2 试验试剂

2 种精油EO1&EO2（上海交通大学芳香植物研发中心提供）；咖啡因（上海纯优生物科技有限公司提供）；地西泮注射液（上海精神卫生中心提供）；戊巴比妥钠（苏州坤宸生物提供）；PBS (0.01M，pH 值7.2-7.4)、无菌生理盐水（上海泰坦科技股份有限公司提供）；小鼠皮质酮（Cortisol）ELISA 试剂盒、小鼠γ 氨基丁酸（GABA）ELISA 试剂盒、小鼠乙酰胆碱（ACH）ELISA 试剂盒、小鼠组胺（HIS）ELISA 试剂盒、小鼠去甲肾上腺素（NE）ELISA 试剂盒、小鼠多巴胺（DA）ELISA 试剂盒（均由上海酶联生物提供）。

1.3 仪器与设备

7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；EPM 高架十字迷宫（上海欣软信息科技有限公司）；Sigma 3K15 离心机（德国Sigma Laborzentrifugen 公司）；Multiskan Go 酶标仪（上海赛默飞仪器有限公司）；XM-650T 超声波细胞破碎仪（上海净信实业发展有限公司）；50 cm×50 cm×25 cm 动物香薰室（上海交通大学芳香植物研发中心自制）；CS-08 三档香薰机（杭州格林爱有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 小鼠模型构建 动物分组：将适应饲养1 周后的小鼠随机分为5 组（n=5×6），即正常对照组CK、模型组、DZP 组（地西泮组）、EO1 组（复方精油1 组）、EO2 组（复方精油2 组）。建模（以睡眠试验的相关指标与CK 组进行比较，出现差异后，视为造模有效）：采用空瓶刺激[19]和咖啡因注射相结合的方法。除CK 组正常饲养不做任何处理外，其余组小鼠实施单只分笼饲养，并在前7 d 的2 个固定时间（每天9:00—9:10 和21:00—21:10）进行饮水训练。饮水训练后，开始空瓶刺激，采用随机数表法，在原来固定供水时间中，一个提供有水的瓶子，另一个只有空瓶，持续刺激12 d。在空瓶刺激的最后2 d，将咖啡因用生理盐水溶解（2 mg·mL-1），并于上午9:30—10:30按10 mg·kg-1的剂量进行腹腔注射。在整个模型建立过程中，动物可以自由获取食物。

1.4.2 精油及药物干预 在最后1 次注射咖啡因后，将2 种复方精油用荷荷巴油稀释成3%的浓度，并置于香薰机放在动物香薰室中央隔层中，开二档进行扩香，将EO1 组和EO2 组分别放置在对应香薰室内，嗅闻30 min；将香薰机中的精油置换成荷荷巴油后，模型组也在香薰室中嗅闻30 min；将地西泮用生理盐水配制成0.2 mg·mL-1的溶液，并以1 mg·kg-1剂量为DZP 组进行腹腔注射。

1.4.3 高架十字迷宫测试 进行3 次高架十字迷宫测试，第1 次在空瓶刺激的第10 天，参与组为CK组和模型组-空瓶刺激；第2 次在空瓶刺激第11天，并注射咖啡因30 min 后，参与组为模型组-空瓶+咖啡因；第3 次在嗅闻精油/地西泮注射后，参与组为DZP 组、EO1 组和EO2 组。将小鼠置于中央区域，头朝向一侧的开放臂放入，开始测试并保持环境安静，记录小鼠5 min 内的行动轨迹，包括小鼠在开放臂（Open arms）和闭合臂（Closed arms）上的进入次数（OE&CE）和停留时间（OT&CT），以及运动总路程。因小鼠还是有一定的个体差异，同时记录了小鼠进入开放壁的比列，即进入率。小鼠的焦虑程度与进入各臂的次数与时间相关，焦虑程度越低，进入开放臂的次数和停留时间越多[20]。

1.4.4 戊巴比妥诱导睡眠测试 第3 次高架十字迷宫测试结束后，以40 mg·kg-1的剂量给各组小鼠进行戊巴比妥钠腹腔注射，并观察，以小鼠翻正反射消失10 s 为入睡信号。从药物注射到翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期，从翻正反射消失到恢复的时间为睡眠持续时间，即睡眠期。同时记录在这个过程中每组进入睡眠期的小鼠数量，即入睡率：

入睡率=入睡小鼠数/组内小鼠总数×100% （4）

1.4.5 小鼠血清和脑组织中神经递质和神经调节剂含量检测 睡眠测试结束后，摘取小鼠眼球，通过眼眶取血0.5 mL，并置于离心机中，在3 000 r·min-1、4 ℃下，离心10 min，取其上清液，采用小鼠皮质酮（Cortisol）ELISA 试剂盒，检测上清液中皮质酮的含量。取血后，处死小鼠，并立即取脑，分离出下丘脑、垂体，置于1.5 mL 冻存管中，保存在液氮中待用。冻存的组织于室温平衡2 h 以上，然后用生理盐水冲洗干净，再用滤纸把周围的水分吸干，称质量；按1∶9质量/体积比（相当于1 g 组织加9 mL 的匀浆液）加入PBS，使用超声细胞破碎仪在冰浴中充分匀浆；组织匀浆后，在2～8 ℃下以3 000 r·min-1离心15 min，收集上清液。采用酶联免疫法，检测下丘脑和垂体中GABA、DA、NE、ACH 和HIS 物质的含量。这些神经递质和神经调节剂调节着睡眠和情绪。

1.4.6 2 种精油成分测定 样品准备：用乙醇-正己烷混合溶液（1∶1，v/v）稀释精油，稀释倍数100 倍，进样量1 uL。

色谱条件：色谱柱DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气氦气（99.999%）；载气流速1 mL·min-1；分流比30∶1；进样口温度260 ℃，升温程序：柱温50 ℃维持3 min，随后以4°C·min-1升至120 ℃，维持10 min，再以2°C·min-1升至220 ℃，维持2 min。

质谱条件：离子源温度230℃；四级杆温度150℃；EI+，70 eV；扫描方式为全扫描。

1.4.7 统计分析 采用VisuTrack 啮齿动物行为视频分析软件（上海欣软信息科技有限公司）分析高架数据。通过IBM SPSS 软件对试验数据进行统计分析，并采用Origin 软件绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 2 种复方精油化学成分分析

通过GC/MS 对2 种精油的成分进行了检测，EO1 共鉴定出65 种精油成分，为检出成分的97.48%，EO2 共鉴定出74 种精油成分，为检出成分的97.42%，并对百分含量＞1%的成分进行了归类统计分析，见表1。含量＞1%的成分主要是烯烃、醇类及酯类3 种化合物，其中含量最高的是乙酸芳樟酯，2 种精油分别为26.99%、27.83%，其次是芳樟醇，EO1 和EO2 依次为20.17%、19.61%；2 种精油虽然在主成分上具有一定的相似性，但是其他成分在含量和种类上存在一定的差别，比如EO1 没有检测出α-檀香醇，EO2 没有检测出α-柏木烯、罗汉柏烯、柏木脑等。2 种精油相对含量较高的成分虽然大致一致，都是以薰衣草的主要成分（芳樟醇、乙酸芳樟酯和乙酸薰衣草酯）为主，但同时也存在一些差别，根据成分决定功效，可以推测2 种精油在后续的试验中也可能在某些方面具有不同的作用结果。

表1 2 种精油成分＞1%的种类及含量

2.2 高架十字迷宫行为学影响

在高架十字迷宫测试中考察了各组小鼠进入开放臂及闭合臂的次数、时间，以及进入开放臂的小鼠比例等，见表2。结果发现，空瓶刺激造模后进入开放臂的小鼠数量减少、进入次数OE 减少，且与CK 组相比差异显著（P＜0.05）、停留时间OT 减少，但活动的总路程增加；在注射咖啡因后，进入开放臂的小鼠数量增加、进入次数OE 增加、停留时间OT 增加，活动的总路程也增加；给空瓶+咖啡因的小鼠注射DZP 后，全部参与试验的小鼠都进入了开放臂、进入次数OE 增加，且与空瓶刺激组相比差异显著（P＜0.05）、停留时间OT 增加，活动的总路程增加，与空瓶+咖啡因组相比差异显著（P＜0.05）；而给空瓶+咖啡因的小鼠嗅闻精油后，2个组进入开放臂的小鼠数量减少了，EO1 组进入次数OE 和停留时间OT 减少，EO2 组进入次数OE 和停留时间OT 增加，活动的总路程都较空瓶+咖啡因组增加。

2.3 戊巴比妥诱导睡眠影响

对实施空瓶刺激和咖啡因注射后的模型组进行戊巴比妥诱导睡眠试验，观察小鼠的睡眠情况，见表3。结果发现，模型组入睡率降低至50%，入睡潜伏期延长，睡眠持续时间缩短，睡眠片段增加；给模型组注射DZP 后，所有参与试验的小鼠均入睡，而且入睡潜伏期缩短，与模型组相比差异显著（P＜0.05），睡眠时间延长，且与模型组相比差异显著（P＜0.05），中途只苏醒1 次；给模型组嗅闻精油后，2个精油组的入睡率均增加达到80%以上，EO1 组入睡潜伏期明显缩短与模型组相比差异显著（P＜0.05），睡眠时间延长，中途也只苏醒1 次，而EO2组入睡潜伏期却延长了，且睡眠时间也缩短了，睡眠片段增加。有研究已证明，睡眠中断会恶化情绪[21-22]并加剧焦虑相关症状[23]，从睡眠行为表现上看，EO1效果明显优于EO2，但比DZP 效果稍差。

2.4 精油干预对神经递质/神经调节剂的影响

2.4.1 精油干预后对皮质醇（Cortisol）的影响 大量研究已经表明，皮质醇含量与焦虑情绪有着直接关系，在一定范围内，皮质醇的含量越低，焦虑程度就越轻。本研究完成各组处理后，对各组按试验方法进行采血，并取其血清，通过酶联免疫法检测各处理组血清中Cortisol 的含量，见图1。结果发现，与CK组相比造模后，模型组Cortisol 含量明显升高，差异显著（P＜0.05）；将模型组随机分为3 组，一组给予阳性药DZP，一组嗅闻EO1，最后一组嗅闻EO2，3 组Cortisol 的含量都降低了，并且DZP 组与模型组相比，具有显著性差异（P＜0.05）。2 个精油组与模型组相比，具有极显著性差异（P＜0.01）。这说明阳性药与精油对焦虑都有一定的缓解效果。

图1 血清中皮质醇的含量

2.4.2 精油干预后对γ 氨基丁酸（GABA）的影响GABA 是中枢神经系统中一种最重要的抑制性神经递质，通过一系列生化反应后，对机体具有镇静、催眠的效果[24]。有研究也发现，大脑中GABA 含量水平的降低，与焦虑症、抑郁症等发生有一定联系[25]。本研究对各处理组采血后，立即处死，分离出下丘脑、垂体，匀浆后，提取上清液，检测其中GABA 的含量，见图2。造模后，模型组中GABA 的含量与CK 组相比明显降低，具有极显著性差异P＜0.01；将模型组随机分为3组，一组给予阳性药DZP，一组嗅闻EO1，最后一组嗅闻EO2，处理后，3 组GABA 的含量都有所增加，且EO1 组与模型组相比，具有显著性差异（P＜0.05），EO2与模型组相比，达到了极显著性差异（P＜0.01），EO2组与DZP 组相比，也具有极显著差异（P＜0.01），2 个精油组相比，也具有显著性差异（P＜0.05）；与CK 相比，EO2 组GABA 恢复效果最好，甚至高于CK 组。

图2 下丘脑、垂体中分泌γ 氨基丁酸(GABA)的含量

2.4.3 精油干预后对多巴胺(DA)的影响 DA 是普遍存在于动物和人神经系统中的一种重要的神经递质，降低DA 的水平可导致抑郁，表明DA 与焦虑、抑郁之间有着密切的关系[26]。同时，DA 也与睡眠之间存在一定的关系，荣霏等[27]研究发现，对大鼠实施慢性睡眠剥夺后，其下丘脑中DA 的含量减少。本研究分析了各处理组中下丘脑、垂体中分泌的DA 含量，见图3。造模组中，DA 含量与CK 相比显著降低（P＜0.01）；造模组给予DZP 或EO2 后，DA 有所上升，但都不具有显著性差异。当让造模组嗅闻EO1精油后，与模型组相比，DA 的含量明显上升，具有极显著性差异（P＜0.01），并与CK 接近；EO1 组与DZP 组和EO2 组相比，DA 的含量都较之高，且具有显著性差异（P＜0.05）。

图3 下丘脑、垂体中分泌多巴胺（DA）的含量

2.4.4 精油干预后对去甲肾上腺素（NE）的影响去甲肾上腺素是一种主要由蓝斑（LC）产生的神经递质，它与情绪处理和调节中心（例如杏仁核）具有双向连接，并抑制投射到睡眠-觉醒调节的主要枢纽[28]。本研究分析了各处理组中下丘脑、垂体中分泌的NE 含量，见图4。造模后，检测出模型组NE的含量与CK 组相比，明显下降，具有极显著差异（P＜0.01）；对模型组给予DZP、EO1、EO2 不同处理后，下丘脑、垂体中分泌的NE 含量都有所上升，DZP 组与模型组相比，具有显著性差异（P＜0.05），2个精油组与模型组相比，都具有极显著差异（P＜0.01）；并且2 个精油组与DZP 组相比，都达到了显著性差异（P＜0.05）。

图4 下丘脑、垂体中分泌去甲肾上腺素(NE)的含量

2.4.5 精油干预后对乙酰胆碱(ACH)的影响 乙酰胆碱是一种在整个中枢神经系统（CNS）合成的唤醒神经递质，包括但不限于纹状体复合体、基底前脑、间脑、脑桥脑细胞群和髓质，在清醒和快速眼动睡眠期间胆碱能活动较多，在非快速眼动睡眠期间胆碱能活动较少[29]。本研究分析了各处理组中下丘脑、垂体中分泌的ACH 含量，见图5。造模后，模型组的ACH 含量与CK 组相比有明显下降，具有极显著性差异（P＜0.01）；给予造模组实施不同处理后，发现DZP 组、EO1 组和EO2 组的ACH 含量都有所上升，并且与造模组相比，DZP 组和EO1 组，都具有显著性差异（P＜0.05），而EO2 组与造模组相比，达到了极显著性差异（P＜0.01）；虽然EO1 组和EO2 组上升值都高于DZP 组，但它们之间不存在显著性差异。

图5 下丘脑、垂体中分泌乙酰胆碱(ACH)的含量

2.4.6 精油干预后对组胺（HIS）的影响 组胺被认为是促进清醒的“主要”神经递质，抑制组胺可以促进入睡并增加非快速眼动（NREM）睡眠即慢波睡眠[30]。本研究分析了各处理组中下丘脑、垂体中分泌的HIS 含量，见图6。造模后，模型组下丘脑、垂体中分泌的HIS 含量与CK 组相比，HIS 的含量增加了，具有显著性差异（P＜0.05）；对造模组实施不同处理后，发现DZP 组、EO1 组和EO2 组的HIS 含量都有所减少，其中DZP 组与模型组相比，差异显著（P＜0.05），EO1 组和EO2 组与模型组相比，都达到了极显著性差异（P＜0.01）；2 个精油组与DZP 组相比，HI S 的含量都减少了，且都表现为差异显著（P＜0.05），2个精油组之间虽然也有差异，但差异不显著。

图6 下丘脑、垂体中分泌组胺（HIS）的含量

3 讨论与结论

试验中用到的2 种精油从成分上来看，主成分相差不大，都是以乙酸芳樟酯、芳樟醇、柠檬稀、乙酸薰衣草酯为主，但从后面的行为学和神经递质/神经调节剂的分析来看，2 种精油功效上还是存在差异，由此可见，并不是主要成分相近，精油的功效就会一致，它还受其他特征性或微量成分的影响。由此可以推论考虑某种精油是否具有某种功效或者能达到想要的效果，并不能简单的只看精油名称或者其中的主要成分，关键还是要聚焦精油的成分组成。

试验结果也发现，行为测定结果和神经递质/神经调节剂的检测结果并不是对应一致的，从行为测试看阳性试剂要优于精油的表现，但神经递质/神经调节剂的测定趋势则为精油优于阳性试剂，推测可能有2 个原因，一方面该试验属于急性测试，由神经递质/神经调节剂的趋势可能还未显现出来；另一方面睡眠受到多因素的调节，除了试验中检测的物质外，还有其他物质参与其中。但总体而言，从本研究检测的神经递质/神经调节剂来看，2 种精油在睡眠和情绪的缓解中都发挥了积极的作用，具有深入研究的价值。

总之，通过对上述神经递质/神经调节剂的检测分析，发现在进行焦虑协同咖啡因致小鼠失眠造模后，Cortisol、GABA、DA 和NE 等与CK 组相比都发生了变化，并且都具有显著性差异。因此，笔者认为这些物质可能都与该模型下的失眠有一定的联系，而且在进行阳性药及精油处理后这些物质也发生了相应的改变，精油的正趋势也优于阳性药，但神经递质/神经调节剂对神经系统的作用是一个复杂的过程，它涉及传递、相互影响等，其作用机理值得我们进一步探讨。