不同培养条件对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

贲海燕，郝永娟，霍建飞，姚玉荣，王万立

（天津市农业科学院植物保护研究所，天津 300384）

草莓白粉病病原菌为真菌子囊菌亚门单囊壳属羽衣草单囊壳菌（Sphaerotheca aphanis），为专性寄生菌。我国于1959 年首次在原沈阳农学院温室草莓上发现白粉病[1]。近年来国内草莓白粉病害愈发严重，尤其是保护地草莓白粉病，从苗期到果实成熟期不间断发生，特别是适宜采摘的‘红颜’‘章姬’等品种对草莓白粉病较为敏感，设施栽培重茬连作棚架及土壤中病原菌积累，以及棚室通风透光性差、种植密度大，棚内适温高湿等原因，致使草莓白粉病发病早且重，一般减产20%～30%，重则减产可达50%、甚至绝收，严重影响了草莓的产量和品质[2]。天津地区多为盐碱地，草莓不耐盐碱，管理不到位，植株生长受阻很容易发生白粉病。目前，对草莓白粉病病原菌的研究报告较少[3-4]，针对草莓白粉病菌生物学特性的研究更是鲜见报道，为进一步明确草莓白粉病菌分生孢子生物学性状，本研究在室内对分生孢子在不同温度、湿度、光照、碳源等条件下的萌发率、芽管长度进行研究，以期为草莓白粉病流行规律研究、药剂筛选及病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试草莓白粉病菌（Sphaerotheca aphanis(Wall.)Braun）为天津市农业科学院植物保护研究所蔬菜病害室采自感病品种纯化后活体保存的菌株。

1.2 试验方法

1.2.1 pH 值对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响 在无菌条件下，用灭菌解剖刀切下约4 cm2的2%水琼脂培养基块，置于载玻片上。将草莓病果表面的新鲜白粉病菌用灭菌毛刷刷至pH 值分别为4、5、6、7、8、9、10 的无菌水溶液内，取10 μL 滴在水琼脂块表面，盖上盖玻片，将载玻片置于有湿润滤纸的培养皿内，每组处理3 次重复。将培养皿置于25 ℃培养箱中黑暗培养，分别在0、18、24、48 h 取出，并用光学显微镜观察分生孢子的萌发情况：芽管长度超过分生孢子短径的1/2 记为萌发，于20×10 倍显微镜下观察统计分生孢子萌发数，每视野40～50 个分生孢子，随机取5 个视野统计分生孢子的萌发率并测量芽管长度。

0 h 为试验处理前初始孢子萌发率（以下同）。为准确的表示各处理真实的孢子萌发情况，处理前需统计已萌发的孢子数量，即0 h 观察记录的初始孢子萌发数量，再分别用培养18、24、48 h 的孢子萌发率减去未处理的初始萌发率作为最终的萌发率结果。

1.2.2 碳源对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响 配制2%葡萄糖培养基（每100 mL 2%水琼脂中加入2 g 葡萄糖）、2%蔗糖培养基（每100 mL 2%水琼脂中加入2 g 蔗糖）、2%果糖培养基（每100 mL 2%水琼脂中加入2 g 果糖）、2%淀粉培养基（每100 mL 2%水琼脂中加入2 g 淀粉）；用新鲜草莓果肉捣碎、纱布过滤，获得草莓煮沸汁液备用。采用琼脂培养法，在无菌条件下，将各处理培养基融化后，倒入灭菌培养皿中一薄层（厚度约为2～3 mm），待凝固后用灭菌解剖刀切下约4 cm2的培养基小块，置于载玻片上，并将事先准备的草莓白粉病果上的霉层直接蘸取到培养基表面上待用。

试验设6 个处理，以只加蒸馏水的2%水琼脂玻片为对照，各处理培养基蘸取白粉病菌霉层后分别进行如下处理：①2%葡萄糖培养基滴加10 μL 蒸馏水；②2%蔗糖培养基滴加10 μL 蒸馏水；③2%果糖培养基滴加10 μL 蒸馏水；④2%淀粉培养基滴加10 μL 蒸馏水；⑤2%水琼脂培养基滴加10 μL 草莓汁煮沸液；⑥2%水琼脂培养基滴加10 μL 蒸馏水（CK），各处理完成后盖上盖玻片。每组处理3 次重复。培养条件同1.2.1，于0、18、24、48 h 取出镜检，随机取5 个视野统计孢子萌发率并测量芽管长度。

1.2.3 不同光照条件对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响 取10 μL 白粉病菌孢子悬浮液（浓度为1×105个孢子·mL-1，pH 为7）接种于2%葡萄糖培养基玻片上，分别进行24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 黑暗-12 h 光照3 个处理，每处理3 次重复，在温度为25 ℃、相对湿度100%的培养箱中培养。萌发率统计同1.2.2。

1.2.4 温度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

（1）不同温度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响。取孢子浓度为1×105个孢子·mL-1的悬浮液10 μL，接种于2%葡萄糖培养基玻片上，分别置于5、15、20、25、30、35 ℃，相对湿度100%、全光照的培养箱中培养24 h，每处理3 次重复，于0、18、24、48 h取出在显微镜下观察，随机取5 个视野统计分生孢子萌发率并测量芽管长度。

（2）草莓白粉病菌分生孢子致死温度测定。刷取发病草莓叶片上白粉病菌制成pH 为7、孢子浓度为1×105个孢子·mL-1的孢子悬浮液，分别置于35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45 ℃的水浴锅中，悬浮液达目标温度后保持恒温水浴10 min 后，取10 μL接种于2%葡萄糖培养基玻片上；对照不进行水浴处理，在温度为25 ℃、相对湿度100%的光照培养箱中培养，以上处理均重复4 次。分别在0、24 h 时取出，于20×10 倍显微镜下观察统计分生孢子萌发数，芽管长度超过分生孢子短径的1/2 记为萌发，每视野40～50 个分生孢子，随机取5 个视野统计孢子萌发率。

1.2.5 湿度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响利用饱和盐溶液使干燥器的相对湿度分别控制在100%、92%、81%、67%、52%、34%、20%共7 个处理，将10 μL、孢子浓度1×105个孢子·mL-1的菌悬液接种于2%水琼脂玻片上，置于不同相对湿度的干燥器中，密闭后25 ℃、全光照培养，分别在0、18、24、48 h 取出镜检，每个处理3 次重复。萌发率和芽管长度统计同1.2.2。

1.3 统计分析

使用Excel 2010 和SPSS 22.0 对试验数据进行统计分析，采用Duncan’s multiple range test 进行多组样本间的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 pH 值对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

由图1 可知，草莓白粉病菌分生孢子在pH 值5～10 下均有不同程度萌发。当培养18 h，在pH 值6～8 处理环境下，分生孢子整体萌发率高于其他处理；随着培养时间的延长，各处理孢子萌发呈上升趋势。培养48 h 后，pH 值为7 的孢子萌发率最高，值为44.7%，其次是pH 值为8 的处理值为26.4%，pH值为5 和10 处理的孢子萌发率最低，仅为2.2%～2.6%，而pH 值为4 处理，未见孢子萌发。

图1 pH 值对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

由图2 可知，酸碱环境对孢子芽管长度的影响存在差异，其中pH 值为7 和8 环境培养18 h 的芽管长度显著长于其他处理，且各处理芽管长度与培养时间呈正比。当培养48 h 时，pH 值为7 处理的芽管长度最长达484.25 μm，且偏碱性环境下更有利于芽管伸长。以上结果表明，pH 值为6～8 的环境条件下更有利于草莓白粉病菌分生孢子的萌发及芽管的生长，最适pH 值为7。

图2 pH 值对草莓白粉病菌芽管伸长的影响

2.2 不同碳源条件对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

由不同碳源条件培养草莓白粉病菌分生孢子的试验结果（图3、图4）可知，各处理的孢子萌发率、芽管长度与培养时间呈正相关。各处理对孢子萌发的影响存在显著差异（图3）。培养18 h 后，草莓汁煮沸液的萌发率最高，其次是2%葡萄糖培养处理，显著高于2%淀粉培养基和2%果糖培养基的萌发率；随着培养时间延长萌发率上升，当培养48 h，2%葡萄糖培养基处理的萌发率最高达47.96%，此时草莓汁煮沸液和2%蔗糖培养基培养处理的孢子萌发率也能达到39.07%和36.53%，明显高于水琼脂对照处理的萌发率，而2%果糖和2%淀粉处理对孢子萌发抑制作用显著，低于对照处理的萌发率。

图3 不同碳源条件对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

由图4 可知，各处理芽管萌发长度与培养时间呈正相关。培养18 h 后，以蔗糖为碳源处理的孢子芽管长度最长，平均值达（260.9±6.4）μm；随着培养时间的延长，以葡萄糖为碳源处理的芽管长度迅速增长，培养24、48 h 的芽管平均长度分别为（350.8±9.6）μm 和（500.7±10.1）μm，蔗糖处理次之，显著长于对照处理及其他处理；以草莓果汁、果糖、淀粉为碳源的处理对芽管伸长有一定抑制作用，与对照处理相比，芽管生长缓慢，培养48 h 的芽管平均长度分别为（191.0±2.4）μm、（167.0±4.9）μm 和（140.6±6.0）μm，与对照处理相比，芽管长度短了（160.1～210.4）μm。由此可见，草莓白粉病菌分生孢子在以葡萄糖为碳源的条件下有较强的适应性。

图4 不同碳源条件对草莓白粉病菌芽管萌发的影响

2.3 不同光照条件对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

将结果进行差异显著性分析，结果表明不同光照条件对孢子萌发的影响存在显著差异。由图5 可知，连续24 h 光照处理的孢子萌发率显著高于连续24 h 黑暗处理的萌发率，光照处理组的萌发率可达44.40%；24 h 黑暗处理的孢子萌发率显著高于12 h黑暗-12 h 光照处理的萌发率。由图6 可知，24 h 光照处理与24 h 黑暗处理的孢子芽管长度差异不显著，但显著长于12 h 黑暗-12 h 光照处理组。

图5 光照对草莓白粉病菌孢子萌发的影响

图6 光照对草莓白粉病菌孢子芽管长度的影响

2.4 温度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

2.4.1 不同温度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响 由不同温度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响的试验结果（图7）可知，不同培养温度对孢子萌发有显著影响。培养18 h 后，25 ℃培养条件下，孢子萌发率为20.41%，显著高于其他处理；10、15、35 ℃条件下，对孢子萌发抑制作用明显，萌发率为1.26%～2.15%；5 ℃条件下，未见孢子萌发。随着培养时间的延长，15～30 ℃培养处理的孢子萌发数量逐渐增多，其中25 ℃培养处理的孢子萌发率增幅最大，培养48 h 的孢子萌发率达44.13%，其次是20、30 ℃培养处理，萌发率分别为28.42%、20.7%；而5、10、35 ℃培养处理的孢子萌发受限，萌发率在3.14%以下。

图7 温度对草莓白粉病菌孢子萌发的影响

不同温度条件下，草莓白粉病菌的芽管长度明显不同。整个培养过程中，25、30 ℃条件下，芽管长度较长，培养48 h 的芽管长度分别为481.18、472.98 μm，显著长于其他温度处理；其次是20 ℃条件下，培养48 h的芽管长度为410.27 μm；而5～15 ℃及35 ℃条件下芽管伸长受到抑制，培养48 h 的芽管长度在274.64 μm 以下。

图8 温度对草莓白粉病菌芽管长度的影响

2.4.2 草莓白粉病菌分生孢子致死温度的测定从表1 结果能够看出，35、36 ℃培养处理24 h 的孢子萌发率已经很低，萌发率仅为2.79%～3.16%；随着温度升高，萌发率降低，当温度为41 ℃时萌发率几乎接近于零，但仍有2 次重复的显微镜观察视野中有零星萌发的孢子，而42 ℃及以上温度处理，孢子未见萌发，完全受到抑制。以上结果说明，42 ℃为草莓白粉病菌致死温度的临界温度。

表1 不同温度处理对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

2.5 湿度对草莓白粉病菌分生孢子萌发的影响

由试验结果（图9）可知，不同相对湿度处理对草莓白粉病菌分生孢子的萌发有显著影响，且各处理之间的差异较大。培养18 h 后，相对湿度为92%的处理萌发率最高达22.04%，与相对湿度为100%处理的萌发率相当，显著高于其他处理；随着培养时间的延长萌发率整体呈现上升趋势。培养48 h 后，相对湿度为92%、100%的处理萌发率分别达37.35%、40.88%，而相对湿度为20%～67%的处理萌发率为5.11%～15.80%，对白粉菌孢子的萌发抑制作用明显。

图9 湿度对草莓白粉病菌孢子萌发率的影响

不同湿度环境下草莓白粉病菌的芽管长度显著不同（图10），整个培养过程中相对湿度92%～100%的芽长度明显长于其他处理，培养18 h 的芽管长度分别为386.93、397.74 μm；随着培养时间增加，芽管逐渐伸长，其中相对含水量81%～100%的芽管增长幅较大，培养48 h 芽管长度为408.75～437.99 μm，其次是相对湿度52%～67%，而相对湿度20%～34%的芽管伸长显著受到抑制，长度分别为283.99、289.60 μm。

图10 湿度对草莓白粉病菌芽管长度的影响

3 讨论与结论

草莓白粉病是设施草莓栽培的主要病害，草莓白粉病病原菌为Sphaerotheca aphanis，杨俊誉等[2]通过DNA 分子检测，证实S.aphanis 与P.aphanis 的同源性为100%；Pei 等[5]首次报道华中地区的草莓白粉病菌为Golovinomyces orontii。本研究采用的白粉病菌是由草莓果实上采集保存而来，通过形态学和分子生物学方法鉴定为羽衣草单囊壳菌Sphaerotheca aphanis。国内关于草莓白粉病菌的报道多见于发生情况与防治技术方面，如王伟群等[3]、王璐等[4]报道了田间草莓白粉病发生的影响，而目前未见其生物学特性方面的研究[6]。本研究拟通过对草莓白粉病菌分生孢子萌发条件的摸索，为草莓白粉病的物理和化学防治提供新思路。接种初期孢子能否萌发对接种成功有着至关重要的作用，对品种抗病性鉴定、室内药剂筛选均有影响[7-9]。草莓白粉病菌分生孢子萌发的条件中，温度与其他单囊壳白粉菌基本相似[10-12]，分生孢子萌发最适温度为25 ℃，温度过高或过低均会导致分生孢子萌发率下降，笔者在研究中发现，当温度低于10 ℃或高于35 ℃以上，草莓白粉病菌孢子活性受到抑制，萌发率大幅降低，芽管伸长也受到限制，当温度高于42 ℃处理10 min，孢子停止萌发。因此，在草莓白粉病预防中，在晴朗天气持续进行高温闷棚，使棚室温度达到42 ℃以上孢子致死高温，可抑制白粉病菌分生孢子的萌发，从而控制白粉病的发生。相对湿度为81%～100%的高湿环境有利于草莓白粉病菌孢子的萌发和芽管的伸长，湿度越大越有利于孢子萌发侵染，而低湿度环境对孢子萌发、芽管伸长抑制作用明显。环境pH值也是影响白粉病菌孢子萌发的重要因素，通常白粉病菌分生孢子的酸碱度适应范围较广。苦瓜白粉病分生孢子萌发最适pH 值为5～9[13]、烟草白粉病病原菌在pH 值5～8 内的萌发率较高[14]，番茄白粉病病原新番茄粉孢菌在pH 值为3～12 的条件下分生孢子萌发率较高[15]。本研究发现，草莓白粉病菌分生孢子在pH 值为6～8 的环境下萌发率相对较高，且弱碱环境的孢子萌发率高于酸性环境的萌发率。当pH 值为7 时，最适合孢子萌发及芽管伸长。因此，喷施中性水，使草莓植株处于中性环境条件，更有利于草莓白粉病菌的扩繁、传播，以及病原菌活体保存。而pH 值在5 以下或pH 值为9 以上的酸碱环境对草莓白粉病菌孢子萌发抑制作用明显。白粉病菌对光照敏感性差异较大，苦瓜白粉病菌分生孢子萌发最适条件是全黑暗[13]，烟草白粉病菌受光照时长的影响差异不大[14-16]。完全光照条件下，更有利于草莓白粉病菌的孢子萌发，萌发率显著高于完全黑暗及黑暗-12 h 光照处理的萌发率，而孢子芽管长度受完全光照或完全黑暗处理的影响差异不显著。在营养物质的利用方面，草莓白粉病菌更喜欢利用葡萄糖促进其孢子萌发及芽管伸长，而在以果糖和淀粉为碳源的条件下草莓白粉病菌的适应性较差。

草莓白粉病菌分生孢子萌发的最适温度、致死温度分别为25 ℃、42 ℃，喜高湿、中性环境，喜葡萄糖，光照有利于草莓白粉病菌分生孢子萌发。因此，生产中可降低棚室内相对湿度，保持叶片、果实表面无水滴等防治草莓白粉病。生产空闲期间，选择晴朗的高温天气进行高温闷棚，关闭通风口充分密闭棚室，使土壤及棚室内环境温度达到病原菌致死高温，充分切断内部传染源，从而达到物理预防和控制的目的[17-18]。