复合免疫制剂对凡纳滨对虾生长及肠道菌群结构影响研究

郝爽，尤宏争，张振国，徐晓丽，罗璋，毕相东

（1.天津市水产研究所，天津 300221；2.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；3.天津农学院，天津 300392）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是我国主要的养殖对虾种类，然而近年随着集约化养殖快速发展，养殖病害频发，阻碍了产业持续健康发展[1-2]。由于虾类不具备获得性免疫，仅具有天然免疫[3]。因此，提高对虾自身免疫力及抗病力对于防治病害至关重要。复合增强剂能激活机体自身免疫机能、增强抗病力，与当前研发的其他化学药物和疫苗相比，具有绿色、高效、安全等优点[4-6]。目前养殖业中常用的免疫增强剂种类主要有中草药、多糖类、维生素等，但相关研究多以单方制剂为主，对复方制剂研究较少[7-8]。

本研究使用的复合免疫制剂主要成分为β-葡聚糖、中草药、维生素C 磷酸酯和维生素B 等，试验对象为凡纳滨对虾，通过开展养殖投喂试验，研究复合免疫制剂对机体生长和肠道菌群结构的影响，为复合免疫制剂在对虾养殖中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与饲养管理

本研究使用的复合免疫制剂主要成分为酵母多糖、大黄、黄岑、黄柏，以及维生素类，其中中草药购于甘肃卓尼，其他原料购于天津本地。将基础饲料粉碎后，添加0.5%复合免疫制剂混匀，用小型饵料机压制成免疫饲料备用。

试验用健康凡纳滨对虾由天津市晟淼水产养殖有限公司提供，初始体长（6.88±0.53）cm，初始体质量（2.22±0.32）g。试验开始前先对试验用虾进行常规病原检测，确保其机体处于健康状态。凡纳滨对虾暂养14 d 后，随机分为对照组（A1 组）和试验组（A2组），每组设3 个重复，每个重复200 尾虾，分别置于容量为1 000 L 的养殖桶中，水温（24.5±0.5）℃，盐度25，连续充氧保持含量5 mg·L-1以上。

A1 组凡纳滨对虾投喂基础饲料，A2 组投喂免疫饲料。试验开始前禁饲24 h，试验期间每日投饲3次，投喂比例分别为20%、20%、60%，日投饵量为凡纳滨对虾体质量的10%，养殖试验周期28 d。

1.2 样品采集与处理

试验开始后分别于第7、14、21、28 天采集样品，每个重复随机抽取5 尾虾，用无菌生理盐水漂洗剖取出的对虾完整肠道，同一重复5 尾对虾肠道装入无菌冷冻管中合并为一个样本，置于-80 ℃保存，以备肠道菌群检测分析。

养殖试验结束后，统计存活率。每个重复随机抽取30 尾对虾，测量体长、体质量，参照文献[9]方法计算生长性能指标。

1.3 肠道微生物基因组测序分析

提取对虾肠道微生物基因组DNA，针对细菌16S rRNA 基因V3+V4 区片段设计通用引物，PCR扩增后进行产物回收纯化。基于Illumina Nova 平台对构建的小片段文库进行双末端测序，Reads 拼接、过滤后，基于97%一致性将序列聚类成为运算分类单元（OTUs），通过序列比对到Silva132 数据库进行物种注释分析。

1.4 数据处理

生长性能数据用“平均值±标准差”表示，用SPSS 22.0 软件独立样本t 检验进行显著性分析，显著性水平为0.05，极显著性水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 复合免疫制剂对凡纳滨对虾生长的影响

投喂复合免疫制剂28 d 后，凡纳滨对虾各项生长指标见表1。试验组（A2 组）凡纳滨对虾的终末体长、终末体质量、增质量率和体长增长率均高于对照组（A1 组），但差异不显著（P＞0.05）；A2 组对虾存活率显著高于A1 组（P＜0.05）。

表1 复合免疫制剂对对虾生长性能的影响

2.2 复合免疫制剂对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

各组对虾肠道菌群在门水平上组成成分主要有：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、微菌门（Verrucomicrobia）等。试验期间，不同门类菌群在各组肠道中比例发生变化，但变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门总含量均在90%以上，占主要优势（图1）。

图1 不同时间点两组样本在门水平上的物种丰度

各组对虾肠道菌群在属水平上组成成分主要有：假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、弧菌属（Vibrio）、黄杆菌属（Tenacibaculum）、鲁杰氏菌属（Ruegeria），以及其他（Others）等。试验期间，各组菌群比例发生变化，但同一采样时间点，试验组（A2组）弧菌属相对丰度均低于对照组（A1 组）；第28天，A2 组黄杆菌属相对丰度低于A1 组；随养殖时间的延长，A2 组假交替单胞菌属相对丰度逐渐增高；第21 天和28天，试验组假交替单胞菌属相对丰度均高于A1 组（图2）。

图2 不同时间点两组样本在属水平上的物种丰度

3 讨论与结论

3.1 复合免疫制剂对凡纳滨对虾生长的影响

大量研究表明，复合免疫制剂能促进水产养殖动物的生长，但促生长的效果与复合免疫制剂的种类、添加量、投喂策略以及水产动物品种等都有密切关系[10-11]。

周岐存等[12]在凡纳滨对虾饲料中添加维生素C2 磷酸酯，养殖前4 周对虾生长水平显著提高；郭文婷等[13]试验表明，凡纳滨对虾增质量率与饲料中富含黄酮类化合物的中草药制剂浓度呈正相关；赵红霞等[14]研究发现，凡纳滨对虾体质量、增质量率和特定生长率，随着饲料中β-1，3 葡聚糖添加量的增加而呈现先上升后下降的趋势。本研究中，连续投喂0.5%添加量的复合免疫制剂对凡纳滨对虾生长无显著影响。王芸等[15]用复方中草药饲喂凡纳滨对虾，连续投喂组的生长性能显著优于对照组，但间断投喂组与对照组之间无显著差异；Luo 等[16]研究表明，间隔投喂或连续投喂200 mg·kg-1的β-葡聚糖对凡纳滨对虾生长速度均没有促进作用；熊家等[17]研究表明，连续投喂8 周不同添加水平的酵母水解物，凡纳滨对虾的增质量率和特定生长率均未产生显著变化，与本研究结果相似。不同试验结果可能与免疫制剂成分配比、添加剂量，以及免疫制剂投喂策略相关。

3.2 复合免疫制剂对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

对虾肠道微生物菌群与机体免疫、营养、胃肠发育等生理过程密切相关[18]，菌群稳定有益于保持肠道正常消化、吸收，维持肠道的屏障功能，菌群结构优化有助于提高机体免疫力和抗病力[19-20]。

已有研究表明，变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门是健康凡纳滨对虾肠道中门水平上的的主要指示生物[21-22]。本研究中，在门水平上，试验组和对照组对虾肠道菌群各种类相对丰度有所不同，但菌群种类组成比较相似，试验期间两组对虾肠道中变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门均处于优势地位。黄钦城等[23]在饲料中添加壳聚糖和霉菌毒素，各组凡纳滨对虾肠道中不同门类菌群比例发生了变化，但每组变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门总含量均达90%左右，这与本研究结果相似，说明饲料中添加0.5%复合免疫制剂，不会破坏对虾肠道主体菌门类的优势地位。

弧菌属和黄杆菌属在水生动物养殖环境中普遍存在，是健康对虾中肠道中常见菌群[24]，其中有些种类是条件致病菌，大量繁殖可能增加对虾感染疾病的风险[25-27]。假交替单胞菌属能分泌多种生物活性物质、抗生素及胞外酶等，具有抗菌、溶菌、降解纤维素等功能[28]。Sonnenschein 等[29]对全球多地海水中的一种鲁杰氏菌（Ruegeria mobilis）进行了功能基因组分析，发现其基因组中存在大量原噬菌体和毒素抗毒基因，认为具有作为水产益生菌开发的潜力。本研究中，在属水平上，两组对虾试验期间肠道菌群中占优势地位的主要有假交替单胞菌属、弧菌属、黄杆菌属、鲁杰氏菌属，这与许多学者研究结果相似，但组间菌群结构存在差异：同一采样时间点，试验组弧菌属相对丰度均低于对照组；第28 天，试验组假交替单胞菌属相对丰度达到最高，而柱状黄杆菌属相对丰度低于对照组。试验过程中，组间菌群结构的变化差异，说明饲料中添加免疫制剂能增加有益优势菌群丰度，抑制条件致病菌增殖，有效调节虾类肠道微生态平衡。

综上，在本试验条件下，连续投喂28 d 复合免疫制剂，可以改善凡纳滨对虾肠道菌群结构，提高养殖成活率，且不会对生长性能产生负面影响。由于本研究中只设置了一种添加剂量和投喂方式，在其他添加剂量及投喂策略下，复合免疫制剂对凡纳滨对虾的生长指标影响，还有待进一步研究。