青叶胆多酚复合酶协同超声辅助提取工艺及抗氧化性研究

林采青，杨申明，王振吉，李汝艳，木慧，许斌彬

（楚雄师范学院资源环境与化学学院，云南 楚雄 675000）

青叶胆（Swertia mileensis），又称弥勒獐牙菜、肝炎草、走胆药、小枯草等，为龙胆科獐牙菜属植物青叶胆Swertia mileensis T.N.HoetW.L.Shih 的干燥全草[1]，主要分布于我国云南、西藏、四川等地。青叶胆有清肝利胆、清热利湿的功效，在《云南中草药》中记载：“清肝胆湿热，除胃中伏火，治肝炎，尿路感染”。研究表明：青叶胆中齐墩果酸、苷类和酮类化合物在HBV、糖尿病、降血脂等方面具有良好的生理活性[2]。

目前，国内外对青叶胆的研究主要集中在化学成分、药理作用等[3-5]方面，未见有关SMP 提取及活性方面研究。植物多酚是一类多羟基酚类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、防治心脑血管疾病等多种功效[6]，而且来源广、毒性低，是许多新药开发的重要来源。因此，从植物中提取多酚并对其活性研究，对开发利用植物多酚具有重要意义和价值。

本研究以青叶胆为材料，采用复合酶协同超声辅助提取其多酚，研究了酶解温度、酶解时间、液料比、乙醇体积分数、超声功率、复合酶用量（木瓜酶用量、纤维素酶用量）等对SMP 提取量的影响，通过响应面试验优化了提取工艺条件；同时，对SMP 从清除DPPH 自由基、亚硝酸根离子的能力2 个方面来研究其抗氧化性，旨在为SMP 开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂 青叶胆产自云南楚雄，经鉴定为龙胆科植物青叶胆（Swertia mileensis）的干燥全草；没食子酸标准品（HPLC≥98.0%）、福林酚（分析纯）、纤维素酶、木瓜酶：北京萦莱宝科技有限公司；DPPH 自由基：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；维生素C：西陇科学股份有限公司；无水对氨基苯磺酸钠：天津市大茂化学试剂厂；N-1-萘乙二胺盐酸盐：天津市光复精细化工研究所；其他所用试剂均为AR。

1.1.2 仪器与设备 UV-2100 型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SK8210HP 型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；CP214C 型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 青叶胆材料处理 青叶胆→洗净晒干→烘干（60 ℃）→粉碎→过60 目筛→青叶胆粉→石油醚（沸程30～60 ℃）浸泡12 h→索氏回流提取5 h（脱脂）→烘干（60 ℃）→得到去除色素和油脂的青叶胆干粉（备用）。

1.2.2 标准曲线绘制 采用Folin-Ciocalteu 法测定多酚含量[7]。以没食子酸质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。其回归方程y=117.29x+0.014 9，线性回归系数为R2=0.999 1。

1.2.3 SMP 提取量计算 多酚提取量计算公式为：

式中，Y 为样品中多酚提取量（mg·g-1）；C 为待测液中多酚质量浓度（mg·mL-1）；V 为提取液的体积（mL）；N 为稀释倍数；M 为青叶胆粉的质量（g）。

1.2.4 单因素试验 分别考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL·g-1，乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%，酶解温度20、30、40、50、60 ℃，酶解时间10、20、30、40、50、60 min，超声功率200、250、300、350、400、450、500 W，复合酶用量（0%+6%、1%+5%、2%+4%、3%+3%、4%+2%、5%+1%、6%+0%，其中前者为木瓜酶，后者为纤维素酶），依次考察不同因素下各水平对SMP 提取量影响，以获得复合酶协同超声辅助提取SMP 的较佳水平。

1.2.5 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，选取对SMP 提取量影响较为显著的酶解温度、液料比、乙醇体积分数、复合酶用量为自变量，SMP 提取量为因变量，设计4 因素3 水平响应面试验优化SMP 提取工艺参数，设计因素水平如表1。

表1 响应面分析因素及水平

1.2.6 抗氧化性测定 参考文献[8-9]方法，稍作修改。取2.0 mL 不同质量浓度（0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007 mg·mL-1）SMP 溶液和2.0 mLDPPH 溶液（0.2 mmol·L-1）放入试管中，避光放置30 min，在517 nm 处测定其吸光度记为A1；同样方法测定2.0 mL 无水乙醇和2.0 mLDPPH 溶液混匀后的吸光度记为A2；2.0 mLDPPH 溶液加入2.0 mL 蒸馏水的吸光度记为A0。用维生素C 作对照，DPPH·清除率计算公式为：

参考文献[10]方法，稍作修改。取不同质量浓度（0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007 mg·mL-1）SMP4.0 mL 于具塞试管中，加入0.01 mg·mL-1亚硝酸钠溶液4.0 mL，于37 ℃水浴中反应30 min 后，加入0.4%对氨基苯磺酸溶液1.0 mL，静置5 min。随即加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.10 mL，加蒸馏水定容至25 mL，静置15 min 后，于530 nm 下测吸光值记为A1。以4.0 mL 蒸馏水替代样品测吸光记为A0，用维生素C 作对照。清除率计算公式为：

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比的影响 在复合酶用量6%（3%纤维素酶、3%木瓜酶）、乙醇体积分数60%、超声功率200 W、酶解温度30 ℃、酶解时间30 min 的条件下，液料比对SMP 提取量影响见图1。从图1 可以看出，在液料比10∶1～35∶1mL·g-1范围内，随着溶剂用量增大，SMP 提取量呈现先增大后减小的趋势。当液料比为30∶1 mL·g-1时，SMP 提取量达到最大16.39 mg·g-1。这可能是液料比的增加使提取基质细胞内部和外部的多酚物质质量浓度差增大，有利于多酚提取。当但液料比超过30∶1 mL·g-1时，超声空化能量密度的降低占了主导地位，对多酚提取不利[11]。因此，适宜的液料比在30:1 mL·g-1附近。

图1 液料比对SMP 提取量的影响

2.1.2 乙醇体积分数的影响 在复合酶用量6%（3%纤维素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1mL·g-1、超声功率200 W、酶解温度30 ℃、酶解时间30 min 条件下，乙醇体积分数对SMP 提取量的影响见图2。从图2 可以看出，乙醇体积分数在40%～80%范围内，SMP 提取量随乙醇体积分数的增大提取量先增大后减小趋势，当乙醇体积分数为60%时SMP 提取量达最大为14.94 mg·g-1。这可能是一定浓度的溶剂能够破坏酚类与多糖和蛋白质之间的氢键和疏水作用力，使其提取量增加，而当浓度过高时导致其极性差异大反而使提取量减少[12]。因此，适宜的乙醇体积分数在60%附近。

图2 乙醇体积分数对SMP 提取量的影响

2.1.3 酶解温度的影响 在复合酶用量6%（3%纤维素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇体积分数60%、超声功率200 W、酶解时间30 min 条件下，酶解温度对SMP 提取量的影响见图3。从图3可以看出，在酶解温度40 ℃时，多酚提取量达到最大值15.35 mg·g-1，超过40 ℃以后，多酚提取量不再增加而有减小的趋势，适宜的酶解温度能促进多酚物质的充分溶解，但多酚物质在高温下不稳定，易被氧化分解，过高的温度反而使多酚提取量下降[13]。因此，适宜的酶解温度在40 ℃附近。

图3 酶解温度对SMP 提取量的影响

2.1.4 超声功率的影响 在复合酶用量6%（3%纤维素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇体积分数60%、酶解温度40 ℃、酶解时间30 min 条件下，超声功率对SMP 提取量的影响见图4。从图4可以看出，在超声功率200～500 W 范围内，多酚的提取量呈先增大后减小的趋势。当超声功率增加至300W 时，提取量达到最大值14.60 mg·g-1，之后随着超声功率的增大，多酚提取率呈现下降的趋势。因此，较佳超声功率在300 W 附近。

图4 超声功率对SMP 提取量的影响

2.1.5 酶解时间的影响 在复合酶用量6%（3%纤维素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇体积分数60%、酶解温度40 ℃、超声功率300 W 条件下，酶解时间对SMP 提取量的影响见图5。从图5可以看出，随着酶解时间的延长，多酚提取量反而呈现下降的趋势。这可能是酶解时间越长，乙醇和多酚间接触时间越长，有利于多酚的释放，但时间太长时，由于多酚不稳定，加之在提取过程中氧气的混入，会导致多酚氧化或分解，使多酚提取量下降[14-15]。因此，较佳酶解时间在50 min 附近。

图5 酶解时间对SMP 提取量的影响图

2.1.6 复合酶（木瓜酶+纤维素酶）用量的影响 在复合酶用量6%（3%纤维素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇体积分数60%、酶解温度40 ℃、超声功率300 W，酶解时间50 min 条件下，复合酶（木瓜酶+纤维素酶）用量对SMP 提取量的影响见图6。从图6 可以看出，SMP 的提取量与木瓜酶用量/纤维素酶用量的值成正比的关系，在木瓜酶用量/纤维素酶用量的值为2∶1 之后，多酚提取量呈下降趋势。因此，适宜的复合酶用量用为木瓜酶用量4%、纤维素酶用量2%附近。

2.2 响应面优化SMP 的提取条件

响应面试验结果如表2。对表2 试验数据应用Design-Expert 8.0.5b 软件进行回归拟合，得到SMP提取量Y 对自变量A、B、C 和D 的回归方程为:Y=16.69+0.7211A+0.044 4B+0.131 4C+0.197 2D+0.074 6AB-0.389 0AC-0.218 5AD-0.005 3BC+0.330 4BD+0.067 14CD-0.883 7A2-0.721 1B2-0.345 5C2-0.385 4D2。

表2 Box-Behnken 试验设计与结果

对回归模型进行了显著性检验与方差分析，结果见表3。由表3 可知，回归模型P＜0.000 1，说明模型极显著，具有统计学意义。失拟项P 值为0.327 1＞0.1，表示失拟项不显著，即拟合良好。R2=0.977 5 与RAdj2=0.955 1 十分接近，说明该模型准确性好。因此，该模型可用于SMP 提取工艺优化和预测。模型因素A、C、D、AC、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2极显著。各因素对SMP 提取量的影响并非线性关系，由表3 中F值大小可知，各因素对SMP 提取量影响程度大小酶解温度＞复合酶用量（木瓜酶+纤维素酶）＞液料比＞乙醇体积分数。

表3 回归模型显著性检验与方差分析

根据建立的模型，应用Design-Expert 8.0.5b软件可预测到SMP 最优提取工艺参数为：酶解温度40.45 ℃，酶解时间50 min，液料比34.88∶1 mL·g-1，乙醇体积分数62.77%，超声功率300 W，木瓜酶用量4.96%，纤维素酶用量1.04%，SMP 最大响应值为17.01 mg·g-1。将优化的提取条件进行调整为酶解温度40 ℃，酶解时间50 min，液料比35∶1 mL·g-1，乙醇体积分数63%，超声功率300 W，木瓜酶含量5%，纤维素酶含量1%。在该条件下进行3 次重复试验，得到SMP 提取量为17.50 mg·g-1，与预测值之间的相对误差为2.88%。这说明该模型优化的工艺条件可作为一种有效提取SMP 的提取方法。

2.3 SMP 抗氧化性分析

2.3.1 清除DPPH·能力评价 SMP 对DPPH·清除作用如图7 所示。由图7 可知，清除DPPH·能力随着SMP 质量浓度的增大而增大，在SMP 质量浓度0.001～0.007 mg·mL-1范围内，当SMP 质量浓度为0.007 mg·mL-1时，对DPPH·清除率为80.3%，与维生素C 清除率（93.7%）相比稍弱，但SMP 也表现出较强的清除DPPH·的能力。

图7 SMP 对DPPH·清除效果

图8 SMP 对清除效果

3 讨论与结论

本研究采用响应面试验优化了复合酶协同超声辅助提取SMP，最佳提取工艺条件为酶解温度40 ℃，酶解时间50 min，液料比35∶1 mL·g-1，乙醇体积分数63%，超声功率300 W，复合酶用量6%（木瓜酶用量5%，纤维素酶用量1%），在该条件测得SMP 提取量为17.50 mg·g-1，与预测值之间的相对误差为2.88%。该试验优化的提取工艺具有提取量高、提取温度低、提取功率小等优点，可作为一种有效提取SMP 的提取方法。

本研究结果表明，青叶胆中含有丰富的多酚类化合物，SMP 具有较强的体外抗氧化活性，相关研究结果对SMP 的提取及抗氧化活性成分的开发利用提供理论依据。但本研究仅对复合酶协同超声辅助提取SMP 进行抗氧化性测定，而采用复合酶协同超声辅助提取是否会影响SMP 生物活性尚未知晓。因此，下一步的研究包含两方面，一方面是对不同提取方法与生物活性间的关系进行研究；另一方面是对SMP 进一步分离、纯化，探讨发挥抗氧化活性的主要成分。