基于等位基因特异性PCR 技术检测Sw-5b 基因

刘文明，华明艳，宋兰芳，崔少杰，孙海波，金凤媚

（天津市农业科学院，天津 300384）

近年来番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）成为继TY 之后的又一危害重大的病害。TSWV 是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的典型成员，可感染84 个科的1 000多种双子叶和单子叶植物[1]。该病毒主要通过蓟马传播，由于该病毒危害性极强，目前已被列为世界第二大危害的植物病毒[2]。

该病最早于1915 年在澳大利亚发现[3]，已在美国[4-5]、伊朗[6]、南非[7]、韩国[8]、印度[9]等多个番茄产区造成了严重的损失。我国于20 世纪80 年代在番茄和烟草中首次检出番茄斑萎病毒[10]，之后随着蓟马危害范围逐年扩大，番茄斑萎病毒在我国多地的多种园艺植物上被发现[11-14]。由于TSWV 的植物宿主范围广泛，生产中很难预防该病，所以将TSWV 抗性基因导入番茄品种已被认为是一种行之有效的预防方法。

在栽培番茄和野生番茄中均发现了抗TSWV的遗传资源，但抗性水平不相一致。迄今为止，已报道了8 个对TSWV 具有抗性基因，分别是Sw1a、Sw1b、sw2、sw3、sw4、Sw-5、Sw-6 和Sw-7[15-17]。在这些基因中，来自秘鲁番茄的Sw-5 基因已被确定对多种布尼亚病毒科病毒有持久抗性[18]。Sw-5 有5 个等位基因（Sw-5a、Sw-5b、Sw-5c、Sw-5d、Sw-5e）和7个同源基因分别分布在9 号染色体和12 号染色体上[19-20]，其中含有Sw-5b 是对TSWV 有抗性的功能型基因，其基因序列已发表在GenBank（AY007366）[21]。Sw-5b 可以限制病毒在体内的广泛传播，仅表现为轻微的过敏性反应。因此，很多育种工作者将该基因作为重点研究对象，并在番茄育种中得到广泛应用[22]。

针对Sw-5b 基因，Shi 等[23]已开发出一个基因特异性PCR 标记，但此标记仅能扩增出抗病基因，对感病基因却无能为力；Lee 等[24]开发出一个基于高分辩率熔解曲线HRM（High-Resolution Melting，HRM）的分子标记方法，但该方法需要用到昂贵的仪器，不能在普通实验室普及。本研究是在Shi 等[23]研究的基础上，利用AS-PCR 方法开发出一种费用低廉的PCR 方法检测Sw-5b。该方法可区分出抗感基因型且操作简单，适合在一般实验室普及。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

抗病纯合：‘LA3667’。

感病纯合：‘cy299-6’。

杂合型：‘3110’为‘LA3667’בcy299’获得的F1 代。

市售商品种：‘1679’‘津杂213’‘津杂214’‘圣迪’‘齐达利’‘Sibeide’。

表1 材料来源

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 番茄材料于天津市农业科学院番茄育种基地种植，并正常管理。采用CTAB法提取番茄叶片总DNA。

1.2.2 抗感品种Sw-5b 基因部分片段克隆 参照文献[23]设计的Sw-5b-f1/r1 引物扩增抗病基因型材料和感病基因型材料。Sw-5b-f1:5'-AACCACTAG GGGCAGTCCTT-3'，Sw-5b-r1:5'-CTCACTATGTGGC TGCTCCA-3'。将获得的片段进行克隆和测序。PCR反应总体积为25 μL，模板DNA 40 ng，Taq DNA 聚合酶0.5 U，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×PCR 缓冲液2.5 μL，5'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL，3'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL。PCR 反应条件为：95 ℃热启动之后，进行PCR 扩增。循环条件为：95 ℃变性5 min，95 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35 次，72 ℃过度延伸10 min。将所有反应物混匀后，于PCR 仪（MJ PTC-200）上扩增。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用奥莱博有限公司的琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收PCR 产物，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆，在Takara 公司进行测序。

1.2.3 抗性基因特异性引物的设计 根据测序结果设计等位基因特异性的引物。为了在不同材料中检测目标SNP（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），采用AS-PCR 方法，设计特异的上游引物，将SNP置于引物的3′端的不同位置并在特异性引物的3′端引入错配碱基，以增强AS-PCR 的扩增效果。利用Primer3（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）再设计一个公用下游引物。特异性引物的3'端分别与抗病品种和感病品种的SNP 位点相匹配。与特异性引物相匹配的等位片段有扩增产物，不匹配的没有扩增产物。

1.2.4 PCR 反应体系 反应总体积为25 μL，包括模板DNA40 ng，Taq DNA 聚合酶0.5 U，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×PCR 缓冲液2.5 μL，5'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL，3'端引物（10 μmol·L-1）2.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃热启动之后，进行PCR 扩增。循环条件为：95 ℃变性5 min，95 ℃30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35 次，72 ℃过度延伸10 min。退火温度视引物而定。将所有反应物混匀后，于PCR 仪上扩增（MJPTC-200）。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 材料的测序验证

将含有抗病基因的品种‘LA3667’和含有感病基因的品种‘cy299-6’进行克隆，经PCR 检测为阳性的克隆（图1）送到上海生工公司测序。测序结果发现抗病品种在3 处有SNP，327 和329 及371 处（图2）。通过美国国家生物信息中心NCBI 的GeneBank 对比，证明克隆获得的片段为番茄Sw-5b基因及其等位基因（GenBank:AY007366）。

图1 引物Sw-5b-f1/r1 的扩增结果

图2 包含SNP 的序列片段

2.2 依测序结果设计引物

选定包括327 和329 等位基因突变位点在内的核苷酸序列片段作为检测抗病基因型的扩增区。设计rg1-F 至rg5-F 作为上游引物，引物rg-R 为下游公用引物，产物大小约为720 bp（表2）。选定包括371 等位基因突变位点在内的核苷酸序列片段作为检测感病基因型的扩增区。设计sg1-F 至sg4-F 作为上游引物，引物sg-R 为下游公用引物，产物大小约为250 bp（表3）。

rg1-F 是来自抗病基因型的原始序列，3' 端正好位于329 突变处。引物rg2-F 与rg1-F 序列相同，但3'端第二个碱基的G 被C 取代，形成C-C 错配。同样地，引物rg3-F 3'端第二个碱基的G 被A 取代，形成A-C 错配；引物rg4-F 3'端第2 个碱基的G 被T 取代，形成T－C 错配。为了检测错配位置对PCR 结果的影响，设计了引物rg5-F。该引物与引物rg3-F 相同，但位置不同，位于3'端的第5 个位点（表2）。

表2 检测抗病基因型特异性PCR 引物

引物sg1-F 是来自感病基因型的原始序列区域，3'端正好位于371 突变处。引物sg2-F、sg3-F、sg4-F 分别在3'端第2 个位点引入G-G、A-G、T-G错配（表3）。

表3 检测感病基因型特异性PCR 引物

2.3 不同引物在抗病品种中的扩增结果

引物rg1-F 是以抗病品种的原序列为引物，将2 个SNP 碱基置于引物的3′端，rg-R 为扩增抗病基因型的公共下游引物。结果表明，退火温度在55～63 ℃的范围内，抗病品种和感病品种中均扩增了相应大小的条带。这证明该引物不能有效阻止基因与引物的错配，从而不能有效区分抗感品种（图3 中的泳道1、2、3）。鉴于此，引物rg2-F、rg3-F 和rg4-F 4在设计时将2 个SNP 之间的位点引入错配碱基。笔者发现不同的错配类型对PCR 的结果有影响。引物rg2-F 和rg4-F 分别由G 换成C，形成C-C 错配和由G 换成T，形成T-C 错配，在扩增时均可扩增出条带，不能区分出抗感基因型（图3 中的泳道4～9）。引物rg5-F 设计原理与rg3-F 相同，但错配位置放在了3′端第5 位。结果表明，在进行PCR 扩增时退火温度在55～60 ℃时扩增不稳定。引物rg3-F 引入AC 错配的引物在退火温度为63°C 可以扩增出抗病基因型而感病基因型没有得到扩增（图4）。因此，引物rg3-F 可以有效区分出抗感基因型。

图3 引物rg1-F,rg2-F 和rg4-F 扩增结果

图4 引物rg3-F 扩增结果

2.4 感病品种不同引物的扩增结果

在感病品种的特异性引物的设计中，引物sg1-F、sg2-F、sg3-F、sg4-F 的设计原理同抗病引物rg1-F、rg2-F、rg3-F、rg4-F 的设计。sg2-F、sg3-F、sg4-F分别引入了G-G、A-G 和T-G 错配。利用这3 个引物对抗病基因型和感病基因型进行PCR 扩增，退火温度从45°C 升高到60°C，2 种基因型中均未扩增出条带，从而不能区分出抗感基因型（图5 泳道4～12）。引物sg1-F 为未引入任何错配碱基的引物，在扩增时退火温度提高到59～60°C 时，在感病基因型中能扩增出250 bp 的条带，而抗病基因型不能被扩增（图5 泳道1～3）。所以引物sg1-F 能有效区分出抗感基因型。

图5 引物sg1-F, sg2-F, sg3-F 和sg4-F 的扩增结果

2.5 退火温度的确定

退火温度是AS-PCR 扩增的重要因素。用引入A-C 错配的引物rg3-F/rg-R 在退火温度范围60～62 ℃时，所有基因型都能扩增出720 bp 的目的条带，但感病基因型的条带随退火温度的升高而逐渐减弱。63 ℃时，只有抗病基因型和杂合基因型的条带被扩增，而感病基因型的条带不能被扩增（图6），所以确定63°C 是临界退火温度。

图6 引物rg3-F/rg-R 在不同温度下的扩增结果

当检测感病基因位点时，引物对sg1-F/sg-R 在退火温度范围为59～60°C 时能够区分不同的基因型。当退火温度高于60°C 时扩增产物不稳定，并且低于59°C时抗病基因型和感病基因型均能扩增出目的条带。

2.6 特异性引物有效性的验证

利用筛选出来的特异性PCR 引物rg3-F/rg-R和sg1-F/sg-R 对市售番茄品种‘1679’‘津杂213’‘津杂214’‘圣迪’‘齐达利’‘Sibeide’进行验证。利用引物rg3-F/rg-R 扩增时，‘Sibeide’‘1679 能够扩增出720 bp 的目的条带（图7-A），而其他4 个品种未扩增出条带。利用引物sg1-F/sg-R 扩增时，‘津杂213’‘津杂214’‘圣迪’‘齐达利’‘Sibeide’和‘1679’能够扩增出250 bp 的目的条带（图7-B）。这表明‘Sibeide’‘1679’为杂合型的品种，‘津杂213’‘津杂214’‘圣迪’‘齐达利’为感病基因型品种。利用引物Sw5b-f1/r1 进行PCR 扩增并测序，结果表明‘Sibeide’‘1679’在327、329 和371 位点分别为C/T、G/A 和C/T（图8-A），而‘津杂213’‘津杂214’‘圣迪’‘齐达利’分别为T、A 和T（图8-B）。这个结果与利用特异性引物rg3-F/rg-R 和sg1-F/sg-R检测的结果一致。直接测序法是检测SNP 的标准[25]，本试验用直接测序法对6 份市售番茄材料进行分析，验证了该体系能有效区分出不同的SNP类型。

图7 引物rg3-F/rg-R(A)和sg1-F/sg-R(B)扩增结果

图8 不同基因型的测序结果

3 讨论与结论

3.1 错配碱基的筛选

在AS-PCR 方法中，选择特异性引物至关重要。为了提高扩增的稳定性，在特定引物中引入了错配碱基。在筛选检测抗病基因型的特异引物时，在2个SNP（327、329）之间引入了C-C、A-C 和T-C 错配。大量试验表明，引入A-C 错配碱基的引物rg3-F，在抗病基因型和杂合基因型中均可观察到目标带。据报道，A-C 错配较弱，T-C 错配较强，C-C 错配中等[26]。本研究中，错配位置是在2 个SNP 之间，这2 个SNP 分别为C 和G，它们比T 和A 更稳定，因此，为了平衡强度，需要引入弱错配。此外，引入中度错配或强错配的引物rg2-F 和rg4-F 均可以扩增出720 bp 的目的条带，这表明它们不能阻止引物和模板的结合。

据报道，引物3′端的1 个碱基错配通常不能完全抑制引物与模板的结合[27]。在本研究中，筛选感病基因型特异引物的时，引入了中度错配（G-G，sg2-F）、强错配（A-G，sg3-F）、弱错配（T-G，sg4-F）和无错配（引物sg1-F）。只有引物sg1-F 能区分不同的基因型，而其他引物均不能扩增出条带。371 位的SNP 相邻的碱基为G 和C，相比于T 和A，它们更稳定。因此，任何错配都可以防止碱基结合。所以，是否在特定的碱基中引入错配，取决于相邻的碱基类型。

3.2 错配位置的影响

在筛选抗性基因型特异性引物时，使用rg5-F，即A-C 错配碱基位于3′末端的第五位（与SNP 不相邻），在PCR 扩增时不稳定（有时观察到带，有时没有观察到）。而使用rg3-F，即A-C 错配位置在3′末端的第2 个碱基（与相邻SNP），能扩增出预期条带。因此，错配的位置影响扩增的稳定性，结果与以前的研究结果一致[26]。这一结果可能与碱基堆积力、氢键以及三维结构有关，也可能与错配碱基和DNA 聚合酶相互作用引起的空间位阻有关[28]。

3.3 退火温度的影响

退火温度是决定PCR 的灵敏度和清晰度的主要因素。较低的退火温度有利于两者的结合，但也非常容易发生非特异性扩增；较高的退火温度虽然不容易产生非特异性扩增，却会导致引物和模板结合困难从而使扩增效率降低。因此，退火温度是PCR的关键环节[29]。在本研究中，不同引物的退火温度相差很大，检测抗病基因的引物rg3-F 退火温度达到了63 ℃，而检测感病基因的引物sg1-F 则为59～60 ℃。推测这与引物中GC 含量有很大关系，rg3-F 的GC含量为59%，sg1-F 的GC 含量为33%，GC 含量越高退火温度越高。与普通PCR 退火温度有很大的范围不同，本研究中的引物对温度很敏感，只有在很小的温度范围内能区分不同基因型，引物对rg3-F/rg-R 只有在63 ℃时才能区分抗病和感病基因型，感病基因的引物sg1-F/sr-R 则退火温度为59～60 ℃。这可能是因为普通PCR 在扩增中没有其它模板的竞争，而等位基因特异性PCR 在扩增体系内存在2 个模板的竞争。

3.4 SNP 的检测方法

SNP 是植物基因组中常见且丰富的变异。SNP的检测方法很多，如高分辨率熔解曲线(HRM)[30]、DNA 微阵列[31]、和KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP）[32]。但是这些技术需要精密的设备，因此这些方法不适用于常规的、大规模的、商业化的遗传分析。在本研究中，不同的基因型可以通过一般的PCR 技术来区分，该方法快速有效，适用于番茄抗TSWV 育种。

在本研究中，利用引物rg3-F/rg-R 及sg1-F/sg-R 进行AS-PCR，能够有效区分番茄的不同基因型，该方法为番茄育种工作者在番茄抗TSWV 育种中筛选Sw-5b 抗性基因提供了有力的工具。