急性髓系白血病患者外周血外泌体中miR-4286 表达水平检测及其诊断价值

全海薇, 张亚丽, 王 涵, 艾一玖, 邹雨彤, 夏 薇

（1.北华大学医学技术学院血液检验教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学附属医院血液科，吉林 吉林 132011）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种造血系统恶性肿瘤，好发于成人，具有高复发率和高死亡率等特征［1］。外泌体是细胞膜衍生的囊泡，携带信使RNA（mRNA）、蛋白质和微小RNA（microRNAs，miRNAs）等大量信号分子，广泛分布于血清、尿液和唾液等体液中，参与细胞间相互作用，与肿瘤发生发展有密切关联［2-3］。研 究［4-5］表 明：白 血 病 细 胞 分 泌 的 外 泌 体可通过介导细胞间信号传递抑制造血、重塑骨髓造血微环境、诱导免疫耐受进而提高抗药性，与AML 的发生发展关系密切。miRNAs 是一类长度约为22 nt 的单链非编码RNA，多种外泌体miRNAs 已成为疾病的诊断指标。骨髓间充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和AML 细 胞 分 泌 的 外 泌 体miRNAs 在AML 细胞增殖、凋亡和分化的全过程均发挥重要作 用［6-8］。研 究［9］表 明：BMSCs 源 性 外 泌 体miR-425-5p 靶向Wilms 肿瘤蛋白1 相关蛋白（Wilms’tumor protein 1-associating protein，WTAP）抑制AML 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移。BMSCs 源性外泌体microRNA-7-5p 靶向氧化固醇结合样蛋白11 （oxysterol binding protein-like 11，OSBPL11）延 缓AML 病 程［10］；人 间 充 质 干细胞源外泌体miR-23b-5p 靶向三结构域蛋白14（tripartite motif containing 14，TRIM14）抑 制AML 细 胞 的 生 长［11］；AML 细 胞 源 性 外 泌 体miR-548ac 靶向TRIM28/STAT3 通路参与造血功能 调 节［12］。外 泌 体 内miRNAs 参 与AML 临 床 诊治：外周血外泌体中miR-532、miR-10b和miR-125b表达水平可作为AML 预后不良的诊断指标［13-15］；小鼠外周血外泌体miR-150、miR-155 和miR-1246的联合检测可作为小鼠AML 的诊断指标［16］。二代测序技术的推广和应用为AML 诊疗拓宽思路。分析GEO 数据库基因表达芯片（GSE64029）［17］结果显示：与CD34+的骨髓基质细胞正常分泌的外泌体比较，原代AML 细胞分泌的外泌体中miR-4286表达水平明显升高。本研究结合生物信息学筛选差异表达基因，观察AML 患者和健康对照人群外周血外泌体miR-4286 表达水平，评估外泌体miR-4286 对AML 的诊断效能，为临床诊断AML 提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2020 年2 月—2021 年9 月于北华大学附属医院就诊的45 例AML 初诊患者（AML 组）外周血标本，其 中 男 性23 例，女性22 例，平均年龄（43.4±14.04）岁。AML 患者诊断标准依据《世界卫生组织AML 诊断和分类标准2016》［18］。纳入标准：符合诊断标准的初诊AML 患者；无重要脏器功能损害。排除标准：伴非AML 恶性肿瘤。初诊AML 患者FAB 分型：急性髓细胞白血病微分化型（M0）4 例（8.889%），急 性 粒 细 胞 白 血 病 未 成 熟 型 （M1）4 例（8.889%），急性粒细胞白血病部分成熟型（M2）13 例（28.889%），急性早幼粒细胞白血病（M3）8 例（17.778%），急性粒单核细胞白血病（M4）6 例（13.333%），急性单核细胞白血病（M5）10 例（22.222%）。另随机收集35 名同期健康体检者外周血标本作为对照组，其中男性16 名，女性19 名，平均年龄（33.71±9.52）岁。受试者均已签署知情同意书，并同意参加本研究。本研究获北华大学附属医院医学伦理委员会批准［（2020）年第（04）号］。

1.2 主要试剂和仪器抗CD63 抗体、抗CD9 抗体和羊抗鼠单克隆二抗（英国Abcam 公司），Trizol 试剂、miRNA 反转录试剂盒和TB Green®Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒（日本TaKaRa 公司），实 时 荧 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）引物［生工生物工程（上海）有限公司］。超速离心机（型号：Sorvall WX 100+，美国Thermo 公司），RT-qPCR仪（型号：5100，美国Thermo 公司），透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（型号：HT7700，日本Hitachi 公司），纳米粒度分析仪（型号：Nanotrac wave Ⅱ，美国Microtrac 公司），垂直板电泳系统（型号：PowerPac，美国Bio-Rad 公司）。

1.3 临床标本采集处理用含促凝剂的真空采血管采集受试者静脉血10 mL，4 ℃、3 000 r·min－1离心10 min，分离血清。4 ℃、12 000 g 离心10 min，上清分装至1.5 mL EP 管中，－80 ℃保存。

1.4 外泌体提取将－80 ℃储存的血清置于冰上融化，采用超速离心法［19］提取外泌体。过程如下：血清4 ℃、2 000 g 离心30 min；上清转移至新的离心管，4 ℃、12 000 g 离心45 min；上清转移至超离管，4 ℃、110 000 g 离心2 h。收集沉淀，1 mL无菌PBS 缓冲液重悬。使用0.22 μm 的无菌过滤膜过滤较大囊泡，滤液4 ℃、110 000 g 离心70 min。收集沉淀，200 μL 无菌PBS 缓冲液重悬，－80 ℃保存。

1.5 外泌体鉴定采用TEM 观察外泌体形态：外泌体样品滴加到铜网中心，3%磷钨酸负染色后烘干，于TEM 下观察外泌体颗粒形态并拍照。采用纳米颗粒示踪分析 （nanoparticle tracking analysis，NTA）法检测外泌体粒径：200 μL 外泌体稀释（1∶100）样本混匀后加入样本分析室，设置反应条件（90 s、3 次），分析外泌体粒径。Western blotting 法检测外泌体标志蛋白（CD63 和CD9 蛋白）表达情况：使用RIPA 裂解液提取外泌体内总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分离蛋白，转印至PVDF 膜上。使用5%脱脂奶粉封闭液于室温摇床封闭2 h。加入一抗兔抗人CD9抗体（1∶1 000）和CD63抗体（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育过夜。TBS-T 洗脱3 次后加入二抗稀释液于室温摇床1 h，再 用TBS-T 洗 脱3 次。按说明书配制发光底物，加入发光液，显影并拍照。

1.6 RT-qPCR 法检测外泌体中miR-4286 表达水平外泌体溶液冰上溶解，采用TRIzol 试剂法提取总RNA。使用逆转录试剂盒按说明书逆转录生成cDNA。按照RT-qPCR 试剂盒说明书配制反应体系。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸1 min，40 个循环。miR-4286 正向引 物 序 列：5′-CGTACCCCACTCCTGGTACC-3′。通用引物和U6 引物均为试剂盒自带。以U6 为内 参 基 因，采 用2－ΔΔCt法 计 算miR-4286 表 达 水 平。以2－ΔΔCt值大于3.182 为表达阳性，每个样品设置3 个复孔。

1.7 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件和GraphPad Prism version 8.0 统计软件进行统计学分析。AML 组和对照组外周血外泌体中miR-4286 表达水平均呈非正态分布，以中位数（四分位间距）［M（Q）］表示，组间比较采用非参数曼-惠特尼U检验。绘制ROC 曲线计算外泌体miR-4286 诊断AML 的灵敏度和特异度及AUC，评价miR-4286对AML 的诊断效能。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清外泌体鉴定TEM 观察，分离的外周血外泌体是一种具有脂质双层膜的囊状颗粒，呈一侧凹陷半球形，具有典型的外泌体结构，直径为30～100 nm。见图1。NTA 法检测外泌体粒径，结果显示：粒径呈单峰正态分布曲线，主要分布在30～150 nm，颗粒分散均一。见图2。Western blotting法检测结果显示：AML 组和对照组受试者外周血中外泌体均表达CD63 和CD9 蛋白。见图3。上述结果表明本研究采用的外泌体分离方法可用于后续实验。

图1 TEM 观察AML 患者外周血中外泌体形态表现（Bar=100 nm）Fig.1 Morphology of exosomes in peripheral blood of AML patients observed by TEM（Bar=100 nm）

图2 NAT 法检测AML 患者外周血中外泌体粒径Fig.2 Particle sizes of exosomes in peripheral blood of AML patients detected by NAT method

图3 2 组受试者外周血外泌体中CD63 和CD9 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of CD63 and CD9 proteins in exosomes in peripheral blood of subjects in two groups

2.2 AML 患者外周血外泌体中miR-4286 表达水平RT-qPCR 法检测结果见图4A，AML 组患者外周血外泌体中miR-4286 表达水平［3.788（1.733，9.996）］高于对照组［0.994 （0.641，1.396）］，差异有统计学意义（Z=-5.543，P<0.01）。GEO 数据库基因表达芯片（GSE64029）检测结果显示：AML 组（原代AML 细胞）分泌的外泌体中miR-4286 表达水平高于对照组CD34+的骨髓基质细胞（P<0.01）（图4B）。

图4 对照组和AML 组受试者外周血外泌体（A）和细胞（B）中miR-4286 表达情况Fig.4 Expressions of miR-4286 in cells(A) and exosomes in peripheral blood(B) of subjects in control group and AML group

2.3 外周血外泌体中miR-4286 表达水平诊断效能评估根据外周血外泌体miR-4286 表达水平生成ROC 曲线，评估外泌体miR-4286 对AML 患者的诊断价值，结果显示：外周血外泌体中miR-4286表达水平用于诊断AML 时，AUC 为0.862 9（95%CI：0.774 7，0.937 1，P<0.01）；当诊断临界值为3.182 时，灵敏度为66.67%，特异度为97.14%，具有良好的诊断效能（图5）。

图5 外周血外泌体中miR-4286 表达水平诊断AML的ROC 曲线Fig.5 ROC curves of expression level of miR-4286 in exosomes in peripheral blood in diagnosis of AML

3 讨 论

AML 以克隆性造血干/祖细胞分化障碍、增殖失控和凋亡受抑为特征，具有高度异质性［20］。AML 的诊断已整合细胞形态学、细胞化学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学等多种学科［21］。已被证实有200 多种与AML 相关的分子和染色体异常，但仍有20%～25%的患者无法通过上述指标准确诊断［22］，未来仍需要检测其他生物标志物。

外泌体是直径为30～100 nm、含双层膜结构的囊泡小体，可由多种细胞产生［23］。肿瘤细胞源性外泌体促进肿瘤生长，外泌体病理性改变可应用于肿瘤的诊治［24］。目前可借助外泌体分离技术测定外泌体中蛋白质、mRNA 和miRNAs 等内容物，分析肿瘤特异性和阶段特异性。有研究［25-26］证实：可利用外泌体中miRNAs 含量辅助诊断乳腺癌亚型。研 究［5，7，27-29］表 明：AML 分 泌 的 外 泌 体 在AML 发生发展中发挥重要作用，如参与基因调控网络、携带免疫抑制分子、重塑造血微环境和引发化疗耐药［白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）］，为AML 诊治及预后监测提供新的研究方向。

miRNAs 作为转录后调节因子，与基因表达调控、细胞生物学过程和肿瘤发展有密切关联［5］。外泌体miRNAs 水平在患者外周血中保持稳定，可反映肿瘤细胞生物学特性，协助多种恶性肿瘤的早期诊断和预后评估，其中多种外泌体miRNAs 参与AML 的 发 生 发 展［5］。结 合 生 物 信 息 学 分 析 结 果［17］显示：CD34+的骨髓基质细胞和原代AML 细胞分泌的外泌体miR-4286 表达水平差异有统计学意义。已有研究［30-34］表明：miR-4286 可通过多种作用方式参与肿瘤发生发展，其可通过靶向INPP4A 调控Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号转导和转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription，STAT3）通路、靶向第10 号染色体缺失的磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）调控 PI3K/Akt 通路，调节miR-4286/转化 生 长 因 子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad3 负 反 馈 轴 和miR-4286/BZRAP1轴，参与胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和 TGF-β 信号传递，进而参与调控肿瘤细胞的增殖分化。综上，外周血外泌体miR-4286 或可作为AML 的诊断标志物。

本研究通过超速离心法提取外周血外泌体，对外泌体miR-4286 进行RT-qPCR 法检测，结果显示：与健康人群比较，AML 组患者外周血外泌体中miR-4286 表达水平差异有统计学意义，AML 患者外周血外泌体miR-4286 表达水平明显升高。ROC 分析结果显示：外周血外泌体miR-4286 表达水平诊断AML 的AUC 为0.862 9，灵敏度和特异度较高。联合分析miRNA 靶基因预测软件miRWalk 和miRTarBase 显 示：miR-4286 靶 基 因FANCC、FANCA、TP53、ITGB3 与AML 的 发生发展有密切关联。通过对miR-4286 靶基因GO 和KEGG 富集分析发现：靶基因多集中范可尼贫血复合物、核质和染色质相关功能区域，参与DNA、肽链修复及酶结合，在范可尼贫血通路参与AML 病程。

本研究结果表明：外泌体miR-4286 表达水平可用于辅助AML 诊断，未来可进一步分析miR-4286 对白血病细胞功能的影响，探索miR-4286 基于纳米颗粒药物传递系统作为AML 治疗靶点的可能性。

综上所述，外周血外泌体miR-4286 在AML 患者中表达增强，可以作为AML 的诊断标志物。本研究存在一定局限性：①仅研究了外周血外泌体miR-4286 对AML 的诊断价值，但不排除与miR-125b、miR-150、miR-155 和miR-1246 等 联 合诊断会提高AML 的诊断效能；②本研究仅阐述部分miR-4286 的生信分析结果，预测其在AML 中的信号调控网络，具体机制还有待进一步研究。本研究未来仍需大规模、多中心的临床研究累积数据，推广应用于临床诊断，进一步探索外周血外泌体miR-4286 作为AML 诊断标志物的意义，实现准确快捷诊断AML。