NT5C2在疾病及治疗中的研究进展

舒 玲，霍本念，宋 林

重庆医科大学附属儿童医院 药学部，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014

NT5C2所编码的胞质5’-核苷酸酶Ⅱ(cytosolic 5’-nucleotidase Ⅱ,cN-Ⅱ),可水解肌苷-5’-单磷酸(inosine 5’-monophosphate,5’-IMP)和其他嘌呤核苷酸,在细胞嘌呤代谢中发挥重要作用[1]。近年来,多项研究显示NT5C2在人类多种疾病的发生、发展、治疗中均发挥作用[2-4]。核苷类似物作为癌、病毒性疾病等多种疾病的治疗药物,其在体内可被cN-Ⅱ去磷酸化而导致耐药性的产生以及疾病的复发[5]。此外,NT5C2的表达与2型糖尿病、精神分裂症等疾病的发生和发展均有相关性[6-7]。现有的研究已确定NT5C2及其突变与机体相应的病理改变相关[8]。本文旨在对现有的NT5C2在疾病及治疗中的研究进行综述,为基于NT5C2的相关研究和疾病的治疗提供参考。

1 NT5C2概述

1.1 NT5C2结构

NT5C2位于染色体10q24.32,其编码的蛋白为cN-Ⅱ,为哺乳动物的7个已知5’-核苷酸酶之一[9]。该酶为两个紧密连接的二聚体组成的同源四聚体,cN-Ⅱ有一个α/β结构域,包含一个被8个α-螺旋包围的8股反平行β-折叠,其核心区域包含了其底物核苷磷酸盐的结合位点;而cN-Ⅱ的核心结构域包含5个附加的α螺旋和一些参与亚基相互作用或效应子结合的环结构。晶体学分析发现根据变构调节剂的不同,cN-Ⅱ呈现两种不同活性的构象[1,10]。

1.2 NT5C2功能

NT5C2所编码的cN-Ⅱ作为一种水解酶,广泛分布于机体各组织器官,cN-Ⅱ酶主要参与6-羟基嘌呤为底物的核苷酸反应,优先水解5’-IMP和单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)等,通过去磷酸化生成肌苷和腺苷,调节核苷酸库,维持细胞能量平衡[1]。在生理浓度下的ATP中,形成活性较高的构象,反之,cN-Ⅱ活性降低,进而导致AMP和IMP的积累,可能导致腺苷酸活化蛋白激酶的激活和腺苷的排泄[1]。其生物学作用为参与机体脱氧核糖核苷酸三磷酸和核糖核苷酸三磷酸的水平调节,维持其体内平衡。因此,cN-Ⅱ可以核苷类似物为底物,影响其体内代谢及药物浓度[11]。

2 NT5C2与急性白血病

急性白血病(acute leukemia,AL)为一种以骨髓中白血病细胞无限增殖、分化阻滞和凋亡受抑为特征的恶性克隆性疾病,主要包括急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)。ALL为小儿最常见的恶性肿瘤,仍有逐年上升趋势,目前其治疗产生约80% 5年无事件生存率,但复发后存活率降低[12-13]。6-巯基嘌呤(6-mercaptpurine,6-MP)、阿糖胞苷等核苷类似物为儿童ALL治疗的重要药物,其作为前体在细胞内经激酶磷酸化生成活性代谢物,以抑制DNA生成,并杀灭肿瘤细胞。近年来,ALL耐药和复发的防治得到了国内外学者的广泛关注,多项研究表明NT5C2表达与ALL及AML核苷类似物耐药性和疾病复发有关[8,14]。

2.1 NT5C2高表达与急性白血病的相关性

NT5C2mRNA的高表达与ALL患者预后较差有关,近期有两项研究均显示,急性白血病复发患儿骨髓样本中NT5C2mRNA水平显著高于完全缓解组患儿[15-16]。表明NT5C2mRNA的高表达与急性白血病患者预后较差和疾病复发相关,因此在早期治疗时进行NT5C2mRNA表达水平的监测有利于对疾病进展的早期监控和处理。

2.2 NT5C2突变与6-MP耐药

cN-Ⅱ高表达可导致6-巯基嘌呤[mercapto-purin(hydrate),6-MP]的去磷酸化和清除,进而减少其活性代谢产物的产生,抑制其介导的细胞毒性作用,从而导致耐药[5]。复发的ALL中获得性NT5C2突变会阻碍DNA和巯鸟嘌呤核苷酸(thioguanine nucleotide,TGN)结合物的形成,是6-MP耐药的一个常见机制[3]。有研究对NT5C2进行靶向测序,评估NT5C2变异对ALL患儿6-MP代谢物的个体间差异的影响,结果显示变异体rs58700372与NT5C2转录活性升高和6-MP活性降低(即产生较低的代谢TGN)有关,表明NT5C2种系变异对巯代嘌呤药物处置的患者间变异有显著影响[3]。

为了研究6-MP耐药的分子机制,有研究建立了一系列稳定过表达野生型或突变型NT5C2的ALL细胞系(Nalm6和REH),在Nalm6和REH中,突变体NT5C2的异位表达导致了细胞对6-MP的明显耐药,而过度表达野生型NT5C2的细胞对6-MP仍高度敏感,表明突变体NT5C2不仅是野生型的超活性形式,而可能获得了与6-MP代谢相关的新催化功能,即NT5C2突变改变了6-MP体内细胞代谢,且对内源性核苷酸的平衡和巯嘌呤(thiopurine)诱导的代谢组学反应可能造成了影响[5]。因此,多种机制可能被整合在一起,使携带NT5C2突变的白血病细胞具有6-MP耐药性。

2.3 NT5C2突变与ALL复发

ALL复发是由于亚克隆的出现,亚克隆通过基因改变获得竞争优势,导致对治疗中使用的一种或多种药物产生耐药性。亚克隆ALLNT5C2突变的存在与复发后较差的预后相关[14]。近来,有研究基于数字液滴聚合酶链反应,在6例儿童ALL患者复发前的外周血样本中成功检测到NT5C2的变异[8]。然而,有研究对初始诊断时采集的503例儿童ALL样本队列中的包含NT5C2在内的7个复发相关基因进行深度靶向测序,结果却只在一例非复发病例中检测到亚克隆NT5C2突变,原因可能是在诊断时激活NT5C2突变数量低,突变通常只能在非常小的细胞亚群中检测到,远远低于该研究中的单分子的分子逆转探针(single-molecule molecular inversion probe,smMIP)分析的检测水平[17]。

3 NT5C2与2型糖尿病

2型糖尿病为一种代谢性疾病,其特点是在胰岛素抵抗和相对胰岛素不足的情况下出现高血糖,目前其病因尚不清楚,国内外学者多认为其为多基因遗传性疾病。有研究显示NT5C2为调节2型糖尿病发生与发展的关键基因之一[18]。 高脂饮食小鼠中,Nt5c2敲除小鼠与野生型比较,体质量/脂肪增加减少,葡萄糖耐量提高,血浆胰岛素、三酰甘油和尿酸水平降低;Nt5c2敲除小鼠附睾脂肪细胞更小、更少,脂解率更高,表明小鼠Nt5c2缺失对体质量增加、肥胖、胰岛素抵抗和相关的高血糖有保护作用;Nt5c2的缺失可能通过增加磷脂酰肌醇3-激酶信号,提高胰岛素在高脂血症小鼠中的葡萄糖摄取量[6]。细胞试验显示大鼠胰岛素瘤上皮细胞RIN-m5F 瞬时转染Nt5c2可导致DNA甲基转移酶Ⅰ(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表达下调且胰岛素受体表达上调,Nt5c2敲除可导致DNMT1过表达以及胰岛素受体表达抑制,表明NT5C2参与了胰岛素信号传导[6]。目前仅有的研究表明NT5C2可能是治疗2型糖尿病的一个靶点,但是这需要未来更多的相关研究去验证。

4 NT5C2与精神分裂症

现有研究显示精神分裂症(schizophrenia,SCZ)可能与胎儿和成人大脑中NT5C2表达降低有关[19]。另一项通过整合SCZ的全基因组关联分析(GWAS)汇总统计数据,以及组织特异性表达数量性状位点(eQTL)数据的研究,整合6种不同方法预测的这些致病基因,最终确定了包括NT5C2在内的150个与SCZ相关的潜在候选基因[7]。NT5C2与SCZ有大量的关联性研究,但在理解其潜在机制的过程仍是艰难的,未来需要进一步探索。

5 NT5C2与孤独症谱系障碍

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)为广泛性发育障碍的典型疾病,对患者正常生活有极大影响,其病因尚未明确,近年来临床上多认为与基因异常改变有关[20]。2019年,一项针对640例中国北方汉族自闭症患者的研究结果显示rs11191580与孤独症谱系障碍无关[21];2020年,一项针对中国南方汉族中的602例ASD患者和604名健康受试者的对照研究,结果显示男童rs11191580与孤独症谱系障碍具有相关性。该研究显示在孤独症谱系障碍患者中NT5C2表达失调;此外,rs111191580还可以调节NT5C2在几个脑部亚组织的表达[20]。两项研究的结果不一致,可能的原因是两者样本来源于不同区域,另外后者进行了对照研究,可靠度更高。NT5C2与ASD的相关性还需要在更大的样本中进行确认。

6 NT5C2与遗传性痉挛性截瘫

遗传性痉挛性截瘫是一种罕见的异质性神经退行性疾病,一般伴有精神发育迟滞和运动障碍。cN-Ⅱ在维持脊髓和大脑嘌呤核苷酸和游离核苷酸的平衡中起着重要作用。NT5C2可以调节神经前体细胞中的蛋白质翻译,果蝇Nt5c2直系同源体的神经元表达在爬升实验中被证明会导致运动缺陷[4]。有研究对一个沙特阿拉伯家庭的父母及两例遗传性痉挛性截瘫患儿(年龄分别为5岁和3岁),以及100名健康人群(作为对照组)进行血样提取、全外显子测序和桑格测序,结果显示患儿在第6外显子/内含子交界处,NT5C2可能有一个纯合子剪接体(enst00000343289: c.539+1G>T)的供体改变,且进一步的对照组分析排除了突变的可能性,该剪接改变扩大了NT5C2在神经发育障碍中的突变谱,为进一步解释NT5C2与痉挛型双边麻痺性脑瘫、发育迟缓和小头畸形等之间的相关性提供了新的依据[22]。尽管有这样的证据,未来仍需要用NT5C2敲除试验来证明两者间的相关性。

7 NT5C2与冠心病

冠心病为全球致残和死亡的主要原因,而遗传因素为其发病关键因素之一。在GWAS汇总统计数据中显示NT5C2是冠心病的候选基因[7]。最近,一项针对中国汉族人群的研究,纳入501例冠心病患者作为试验组和496名健康受试者作为对照组,基于dbSNP database等数据库选择在亚洲人群中最小等位频率大于5%的NT5C2SNPs进行检测,包括rs79927334、rs7909022、rs2148198和rs79237883。结果显示rs2148198与汉族人群冠心病的风险密切相关;进一步分层分析显示 rs2148198与男性以及61岁以下个体的冠心病风险增加有关[23]。这些研究都表明了NT5C2与冠心病的相关性,为进一步探究其相关机制提供依据,未来需要更多深入的研究。

8 NT5C2与血压

血压是卒中和冠状动脉疾病最强的遗传风险因素,与其相关的染色体10q24.32基因在人和斑马鱼之间高度保守。基于斑马鱼的研究显示,nt5c2敲除可提高血流量、增加动脉脉搏等;在nt5c2敲除的情况下,抗高血压药物雷米普利无提高血流量的效果,表明nt5c2参与了高血压的发生。该研究还发现nt5c2敲除可诱导另一高血压相关基因Cnnm2下调,Cnnm2敲除也可诱导nt5c2下调。此外,基因敲除的斑马鱼模型还表现出肾功能受损、肾素水平升高,提示nt5c2和Cnnm2依赖的血流参数增加与肾素-血管紧张素-醛固酮信号通路相关[24]。这表明NT5C2或是未来治疗高血压的基因靶点,为治疗高血压提供一个新方向。

9 问题与展望

综上所述,现有研究显示NT5C2与急性白血病、2型糖尿病、精神分裂症、孤独症谱系障碍等多种疾病的发生、发展都可能有相关性,相关突变机制及其在疾病发生、发展过程中的作用机制的阐明,可以为进一步认识疾病和临床诊疗提供依据。目前,针对NT5C2的研究主要集中在急性白血病,已有的研究证实NT5C2可通过影响核苷类似物的体内代谢而导致急性白血病治疗中相关药物耐药的产生和疾病的复发,国外越来越多的研究显示cN-Ⅱ抑制剂的开发是防治ALL核苷类似物耐药和疾病复发的重要途径,并可见cN-Ⅱ核苷类抑制剂相关的研究报道,为ALL耐药和复发提供了新的治疗策略和途径[25]。而在2型糖尿病、精神分裂症等其余疾病中大多还停留在相关性研究,从相关性到了解其机制还有一段距离,仍需要相关的研究进行探索,同时,由于NT5C2广泛分布于机体各组织器官,可能参与了多种疾病的体内过程,未来进一步针对NT5C2在各疾病及治疗中的作用开展研究仍是必要的,而基于NT5C2及cN-Ⅱ的新药研发也有望成为相关疾病的新治疗途径。