PABPC1对人单核白血病细胞系THP-1翻译活性的影响

翟雪莹，王 芳，余 佳

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是成人急性白血病中最常见的类型,是一组基因改变导致的造血干细胞克隆性增殖失调的高度异质性的血液系统恶性疾病[1]。目前,标准化学治疗及联合造血干细胞移植是AML患者临床治疗的主要手段[2]。但是AML在形态学、免疫学表型、细胞遗传学和表观遗传学等方面具有高度的异质性,AML患者间的生存概率和预后差异很大,大多数AML患者经标准化治疗后结果不理想,预后较差[3]。过去10～15年大量研究鉴定出AML中分子和表型的多样性,并揭示了各种AML中分子和免疫治疗靶点的可能性,提供了治疗AML的新思路[4]。细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-1(cytoplasmic poly(A)binding protein-1,PABPC1)在细胞质中介导mRNA的多聚腺苷酸化,参与翻译起始及mRNA降解过程,在肿瘤的发生发展中起重要作用[5]。目前有关PABPC1在AML中的功能鲜有报道,THP-1细胞是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系,本研究以THP-1细胞为研究对象,采用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低PABPC1表达检测其对THP-1细胞翻译的影响,探究PABPC1作为治疗AML潜在靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:商品化人单核细胞白血病细胞系THP-1(北京细胞中心)。

1.1.2 主要试剂:胎牛血清FBS(Life Technologies公司);Sucrose(Amresco公司);DEPC、KCl、Triton X-100、HEPES、DTT(Sigma-Aldrich公司);RNase Inhibitor- EDTA free、DNase Ⅰ(Promega公司);Protein safeTMprotease inhibitor cocktail-EDTA-free(TransGen Biotech公司);Glycerol(Solarbio公司); CHX-2112S(Cell Signaling Technology公司);UltraPureTM1 mol/L Tris-HCI缓冲液、NaCl、MgCl2、RNase Ⅰ、TrizolTMLS Reagent InvitrogenTM、UltraPureTMDNase/RNase-Free Distilled Water(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及处理:取THP-1细胞复苏,用含10%灭活FBS的RPMI-1640培养基培养(37 ℃、5% CO2),待细胞活力较好并增殖满10 cm皿后,将THP-1细胞消化重悬,计数后接种于6孔板中(2×105/孔),将细胞中的培养基更换为无血清无双抗培养基,对细胞进行分组,分别分为实验的对照组和实验组,其中 PABPC1的shRNA序列通过Sigma网站在线设计,挑选已经验证且准确度最高的两条序列作 shPABPC1-1#和shPABPC1-2#,再设计一段无关的随机序列作为对照。其中处理细胞的分组为:1)对照(control)组:按照说明书上的实验参考条件,给细胞培养皿中加入 5 μL Lipofectamine3000和50 μmol/L国际通用的与所有基因均无同源性序列的 nontarget shRNA;2)敲低PABPC1表达组(shPABPC1组):给细胞培养皿中加入5 μL Lipofectamine3000和50 μmol/L shPABPC1。转染24 h后更换新鲜有血清培养基并加入1 mg/L嘌呤霉素进行筛选,筛选的最适药物浓度参考嘌呤霉素的说明书并做相关的药物梯度实验,筛选后继续培养待后续实验。

1.2.2 Western blot检测PABPC1蛋白表达量:待对照组和实验组的THP-1细胞增殖满培养皿后,收集并裂解各组THP-1细胞以提取总蛋白,采用BCA蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度,各样品取20 μg变性的蛋白质进行10% SDS-PAGE电泳并转至NC膜,5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗(PABPC1,1∶1 000稀释、GAPDH,1∶10 000稀释),4 ℃孵育过夜,1×TBST洗涤,加入二抗(HRP标记山羊抗兔,1∶10 000稀释),室温孵育 2 h。1×TBST洗涤,显色,曝光,采用Image J软件进行定量蛋白质分析。

1.2.3 Polysome profiling实验检测细胞的翻译活性:在实验前配制好20%、50%浓度的蔗糖溶液,分别取10 g、25 g蔗糖溶于蔗糖buffer中至50 mL,缓慢倒置摇匀。待对照组和实验组的THP-1细胞增殖满培养皿后,收集并裂解各组已经CHX固定好的THP-1细胞沉淀,离心吸取上清液,在离心期间配置蔗糖密度梯度溶液,金属长吸头安装在10 mL注射器上,使用之前吹空注射器以去除金属吸头内的液体。先加20%浓度的蔗糖溶液,吸入蔗糖溶液插入离心管底缓慢加入直到蔗糖溶液体积到达超速离心管刻度线上方2 mm左右,同样方法加入50%浓度的蔗糖溶液。待加完蔗糖溶液盖上超速离心管的的短帽,在自动梯度仪上选取参数为SW41,sucrose,20%～50%,点击“RUN”键进行梯度制备。运行结束后直接掀开短帽,枪头贴在液面下吸出多余的蔗糖梯度溶液,吸完后沿侧壁缓慢加入样品。待蔗糖梯度溶液中加入样品后,将超速离心管转移至SW1转子的转子架内,拧紧转子盖,在超速离心机38 000 r/min,3 h进行超速离心。离心结束后再按照Biocomp密度梯度分离系统分离样品组分,得到分析结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PABPC1在AML患者中高表达

分析GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中542例AML患者数据和73名健康人数据(图1),相较于健康人,PABPC1在AML患者中的表达量更高,健康人组的相对表达量均值为9.437,AML患者组的相对表达量均值为9.590(P<0.001)。其中542例AML患者数据类型包括:正常核型的AML数据、伴有缺失异位等染色体突变的AML数据、复杂融合型AML数据。

Expression levels of PABPC1 in AML patients and normal pesron using GEO GSE13159 dataset, AML contains 3 differernt subtypes: normal karyotype(n=351), chromosome mutant subtype(n=105), complex subtype(n=86); *P<0.001 compared with normal person

2.2 转染shPABPC1对THP-1细胞中PABPC1的表达水平的影响

图2显示shPABPC1-1#组与shPABPC1-2#组THP-1细胞中的PABPC1蛋白表达水平相较于对照组分别降低了59%(P<0.001)与21%(P<0.01)。THP-1细胞在转染shPABPC1后,其PABPC1表达量明显下降。由于在THP-1细胞中转染shPABPC1-1#的敲低效果更显著,所以选择转染shPABPC1-1#的THP-1细胞进行后续实验。

A.expression of PABPC1 protein in THP-1 cells transfected by shPABPC1; B. relative protein levels of PABPC1 detected by n=3); *P<0.01, **P<0.001 compared with sh-Ctrl group

2.3 敲低PABPC1抑制THP-1的翻译活性

图3显示相较于对照组,敲低PABPC1的THP-1细胞中40 s亚基波峰基本不变,60 s亚基波峰降低,多核糖体部分显著减少,组装形成80S核糖体的亚基在敲低PABPC1组的THP-1细胞中基本上不受影响。

Polysome profiling was used to detect translational activity of THP-1 cells

3 讨论

PABPC1与mRNA中富含腺苷酸的序列结合,在基因转录后调控中发挥着重要作用。同时PABPC1还参与mRNA的许多代谢通路,包括腺苷酸多聚化/脱腺苷酸化、mRNA转运、mRNA翻译、降解及mircoRNA相关调控[5]。

PABPC1在翻译起始过程中起着关键作用,翻译起始是蛋白质合成中的限速步骤,在肿瘤中翻译失控导致的异常激活很重要。PABPC1在翻译起始中的主要作用是通过与eIF4G(eIF4F-m7G帽结合复合物的支架组分)相互作用来介导mRNA的环化,促进mRNA翻译[6]。以往的研究表明,翻译异常,特别是由eIF4F-PABPC1复合物介导的mRNA异常环化可能是肿瘤发展的关键枢纽[7]。

长期以来,AML以其复杂的异质性著称,近年来,一些与翻译相关的药物对特定亚型的AML疗效显著[7-9],例如抗病毒药物ribavirin只作用于M4/M5亚型,对其他亚型的AML翻译抑制效果甚微[7],因此仍然需要寻找新的治疗靶点,开发新的治疗策略惠及更多AML患者[10]。

通过公共数据库结果显示PABPC1在AML中表达量高于健康人,Polysome Profiling结果表明,组装形成80S核糖体的亚基在敲低PABPC1组的THP-1细胞中基本上不受影响,但能够继续进入多核糖体部分进行主动翻译的80S核糖体显著减少,细胞内整体翻译效率降低。敲低PABPC1后,THP-1细胞中不论是mRNA结合核糖体亚基的能力还是mRNA翻译效率均显著降低,推测敲低PABPC1可以抑制THP-1中促癌基因的表达,敲低PABPC1降低肿瘤细胞的恶性表型,从而达到治疗目的。

综上所述,敲低PABPC1可抑制THP-1细胞翻译能力与翻译效率,提示PABPC1在AML发生发展中可能促进肿瘤进展,具有成为AML治疗靶点的可能性。