基于抑菌作用机制的金莲花系列制剂再评价研究

2023-04-29田佩灵刘睿鹏邓妍钟林江雷诗懿伍利华

国外医药抗生素分册 2023年4期

田佩灵刘睿鹏邓妍钟林江雷诗懿伍利华

摘要：目的研究金莲花口服液、片、胶囊及颗粒制剂的抗菌活性及作用机制。方法采用牛津杯法初步摸索金莲花系列制剂的抑菌活性；采用二倍稀释法进一步测定金莲花口服液、片、胶囊、颗粒对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），并通过测定菌体的生长曲线、胞外核酸相对含量和胞外可溶性蛋白质含量研究金莲花系列制剂对金黄色葡萄球菌的抗菌机制。结果 4种金莲花制剂对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性按由强到弱为胶囊、口服液、片、颗粒。4种金莲花制剂对金黄色葡萄球菌菌体生长均显著的抑制效果，其作用机制相同，可增加菌体胞外核酸相对含量和胞外可溶性蛋白质含量趋势，均通过对细菌细胞膜造成损伤改变其通透性，影响细菌生长，使胞内大量渗出，从而起到抑制细菌生长的作用。结论 4种金莲花制剂的抗菌活性不同，对金黄色葡萄球菌的抑菌机制相同，为金莲花系列制剂的质量再评价提供一定参考。

关键词：金莲花系列制剂；抗菌；抗菌活性；抑菌机制；再评价研究；金黄色葡萄球菌

中图分类号：R978.1+9 文献标志码：A 文章编号：1001-8751（2023）04-0263-06

Study on Antibacterial Activity and Antibacterial Mechanism of

Chinese globeflower Series Preparations

Tian Pei-ling1， Liu Rui-peng2，Deng Yan 1， Zhong Lin-jiang 1， Lei Shi-yi1，Wu Li-hua1

（1 Chengdu University School of Pharmacy， Chengdu 610106;

2 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610106）

Abstract：Objective To study the antibacterial activity and mechanism of Jinlianhua oral liquid， tablets， capsules and granules. Methods The Oxford cup method was used as a preliminary investigation of the antibacterial activity of the Jinlianhua series preparations. The minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of Jinlianhua oral liquid， tablets， capsules and granules against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were further determined by double dilution method. The antibacterial mechanism of Jinlianhua series preparations against Staphylococcus aureus was studied by measuring the growth curve of bacteria， the relative content of extracellular nucleic acid， and the content of extracellular soluble protein. Results The antibacterial activities of 4 kinds of Trollius chinensis Bunge preparations against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were capsule， oral liquid， tablet and granule from strong to weak. In order of strength to weakness， the four different Trollius chinensis Bunge preparations have antibacterial activities against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. Four kinds of Trollius chinensis preparations have significant inhibitory effects on the growth of Staphylococcus aureus. The mechanism of action is the same， which can increase the relative content of extracellular nucleic acid and the trend of extracellular soluble protein content. All of them alter the permeability of bacterial cell membranes by damaging them， impairing bacterial growth， and causing huge amounts of body fluid to exude， which prevents bacterial growth. Conclusion The antibacterial activities of the four kinds of Trollius chinensis Bunge preparations are different， and the antibacterial mechanism against Staphylococcus aureus is the same， which provides a reference for the quality reevaluation of Trollius chinensis Bunge preparations. The antibacterial activities of the four Trollius chinensis Bunge preparations were different and the inhibition mechanisms against Staphylococcus aureus were the same， providing some reference for the quality re-evaluation of Trollius chinensis Bunge of preparations.

Key words：Jinlianhua series preparations; antibacterial; antibacterial activity; antibacterial mechanism; re-evaluation research; Staphylococcus aureus

目前收载于《中国药典》2020年版一部中的金莲花系列制剂包括金莲花口服液、片、胶囊及颗粒等，均由金莲花一味中药制得，文献研究发现[1-5]，这4种金莲花制剂的适应症均为上呼吸道感染，但其中金莲花口服液和金莲花胶囊在临床中多用于治疗口腔炎症。上呼吸道感染是一种常见的临床疾病，而金黄色葡萄球菌是导致患者上呼吸道感染的一种重要病原菌，常定植于人群鼻腔中。金莲花对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis，BS）及大肠埃希菌（Escherichia coli，EC）具有一定的抑菌作用，但未对其作用机制进行研究。由于SA、BS及EC为常见细菌，金莲花该味药材抗菌谱较广，因此，本文选取这3种细菌，研究金莲花系列制剂对其抑菌作用机制。

本课题组前期通过综合谱效相关性对金莲花系列制剂的抑菌活性差异进行初步研究，结果表明，金莲花系列制剂因其制备工艺不同，对4种制剂的药效物质作用发挥有一定影响[6]。为探究金莲花4种制剂的制备工艺的差异是否会对其抑菌活性造成影响，本研究以已上市的4种金莲花制剂为研究目标，选用金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌及大肠埃希菌为实验菌种，探索4种金莲花制剂的抑菌活性及其作用机制，对金莲花系列制剂进行再评价，为其4种制剂的临床使用和质量控制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

所有产品均购自市场，金莲花口服液（批号03211214），A厂家；金莲花片（批号2111047），B厂家；金莲花胶囊（批号20210902），C厂家；金莲花颗粒（批号2111157），D厂家；SA、EC、BS菌株由成都大学附属医院赠送；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司，酵母浸出粉、氯化钠、琼脂粉及考马斯亮蓝G-250购自成都市科隆化学品有限公司等；自制LB液体培养基、LB固体培养基等。

按照《中国药典》2020年版一部金莲花制剂项下制备方法，计算金莲花口服液、金莲花片、金莲花胶囊及金莲花颗粒的原药材生药量分别为0.4500 g/mL，4.8387 g/g，2.8571 g/g，0.4255 g/g，取胶囊、片剂及颗粒剂样品，用适量的纯水配制成相同生药量的药液，紫外灭菌后使用，口服液直接使用。

1.2 试验器材

手提式压力蒸汽灭菌器（型号 XFS-280，浙江新丰医疗器械有限公司）；紫外可见分光光度计（型号 TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）；空气浴振荡器（型号 HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；电热恒温培养箱（型号 DH3006A，西安禾普生物科技有限公司）；离心机（型号TG20G，天津广丰科技公司）；超净工作台（型号 JJ-CJ-2FD，苏州市金净净化设备科技有限公司）。其他仪器包括96孔一次性细胞培养板、移液枪、比浊管等。

2 方法

2.1 菌株活化

将细菌分别接种在LB液体培养基中，在摇床中以37 ℃、120 r/min的条件下活化培养细菌12～24 h，制得菌悬液，用高温灭菌后冷却至室温的无菌水将菌悬液浓度稀释至1×106～1×107 CFU/mL，备用[6]。

2.2 抗菌活性研究

2.2.1 牛津杯法

金莲花系列制剂功能主治相同，且4种金莲花制剂除金莲花口服液外均为固体制剂，为排除溶剂选择对抗菌活性实验造成的误差，选用金莲花口服液作为抗菌活性研究对象。

将配制好的固体培养基、纯水、试管、培养皿、牛津杯等放入高压灭菌锅中灭菌1h左右取出，将固体培养基分别倒入培养皿中冷却待凝固后使用，用移液管分别移取菌悬液（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌）1 mL置于固体培养基上使菌液布满整个培养皿，接着均匀摆放6个牛津杯，并向牛津杯中分别加入150 ?L金莲花口服液，在37 ℃条件下恒温培养12～24 h后取出观察。

2.2.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定

取无菌96孔一次性细胞培养板，采用二倍稀释法[6]，在B～H号孔中预先加入100 ?L培养基溶液，在A号孔分别加入100 ?L样品溶液（金莲花口服液、金莲花片、金莲花胶囊、金莲花颗粒），平行设立2组，A号孔再加入100 ?L样品溶液混匀后吸取100 ?L至B号孔，依次进行倍比稀释至F号孔，最后A～G孔均加入10 ?L，1×106～1×107 CFU/mL菌悬液，混匀，且G号孔培养液加相应菌悬液，H号孔只加入培养液作空白对照，待加入菌液接种后，将无菌96孔一次性细胞培养板置于37 ℃恒温培养24 h，培养完成取出观察，若A～F号孔内澄清即视为细菌生长受到了抑制，澄清小孔中所对应的最低药物浓度为对该菌的最低抑菌浓度，同时G号孔中应有细菌生长呈现浑浊状态，而H号孔目的是排除培养液等因素对实验造成的影响应无细菌生长。

2.2.3 最小杀菌浓度（MBC）测定

倒入灭菌后的固体培养基制备好琼脂平板，再将上述实验组中各澄清小孔中的液体分别接种涂布于琼脂平板上，经37 ℃恒温培养12～24 h后观察结果[7]，若琼脂平板上无菌落生长则视为细菌100%被杀灭，此最低药物浓度值为其MBC值。

2.3 抑菌机制研究

2.3.1 抑菌曲线的绘制

调整LB液体培养基中各制剂样液质量浓度为MIC和1/2MIC，然后分别接入500 ?L1×106～1×107 CFU/mL菌悬液，在37 ℃、120 r/min条件下连续培养15 h，每隔1 h取样1 mL，加入无菌水稀释10倍后测定其在600 nm波长处的吸光度，以A600值表示，以不含样品溶液的空白培养基为对照，绘制细菌的生长曲线，每组设2个重复[7]。

2.3.2 胞外核酸相对量的测定

配制样品溶液，使药物质量浓度为MIC和2倍MIC，将500 ?L菌悬液分别加入样品溶液，在37 ℃、120 r/min条件下培养8 h，以空白培养基作对照，每隔1 h定时分别取样500 ?L，加入无菌水稀释10倍后4000 r/min离心10 min，取其上清液于260 nm 波长处测定吸光度，以 A260值表示核酸相对量，每组设2个重复[7]。

2.3.3 胞外可溶性蛋白的测定

配制样品溶液，使药物质量浓度为MIC和2倍MIC，将500 ?L菌悬液分别加入样品溶液，在37 ℃、120 r/min条件下培养8 h，以空白培养基作对照，每隔1 h定时分别取样1 mL，加入无菌水稀释3倍后4000 r/min离心10 min，取其上清液1 mL加入考马斯亮蓝试剂2 mL，静置10 min，于595 nm波长处测定吸光度，以A595值表示胞外蛋白相对量，每组设2个重复[7]。

3 结果

3.1 牛津杯法

实验发现，金莲花口服液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显抑菌圈，表现出良好的抑菌效果和一定的杀菌能力，而金莲花口服液在同一条件下对大肠埃希菌并未显示出抑菌性，见图1～3。已知金黄色葡萄球菌是导致人体上呼吸道感染的一种重要病原菌，而金莲花系列制剂主要治疗上呼吸道感染，同时金莲花中有相关化学成分能有效抑制枯草芽孢杆菌的生长[8]，故选取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌对4种金莲花制剂进行后续机制研究。

3.2 金莲花系列制剂的MIC、MBC测定

本研究采用二倍稀释法测定了金莲花口服液、金莲花片、金莲花胶囊、金莲花颗粒对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的抗菌活性。图4可见，金莲花片浓度≥225 mg/mL，金莲花胶囊浓度≥56.25 mg/mL，金莲花颗粒浓度≥450 mg/mL，金莲花口服液浓度≥ 56.25 mg/mL时的金黄色葡萄球菌溶液澄清；图5可见，金莲花片浓度≥56.25 mg/mL，金莲花胶囊浓度≥14.062 5 mg/mL，金莲花颗粒浓度≥225 mg/mL，金莲花口服液浓度≥28.125 mg/mL时的枯草芽孢杆菌溶液澄清。

上述可得4种金莲花系列制剂对2种试验菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均不同（表1），说明在相同生药量情况下，不同金莲花制剂具有不同的抑菌效果，也就是不同制剂在服用生药量相同的情况下，其抑菌活性有异。金莲花系列制剂对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均能显示出较强的抑菌活性，但基于金莲花系列制剂的功效，选取导致人体上呼吸道感染的重要病原菌即金黄色葡萄球菌进行后续作用机制研究。

3.3 金莲花系列制剂对金黄色葡萄球菌的抗菌机制

3.3.1 对细菌生长曲线的影响

4种金莲花制剂作用后的金黄色葡萄球菌与不含样品溶液的空白对照组相比生长显著减缓，且随着质量浓度的升高，对SA的抑制效果更为明显，当培养液中各金莲花制剂浓度为MIC时，培养液中细菌生长速率明显减缓，表明各金莲花制剂对SA的生长具有明显的抑制效果，结果见图6～9。

3.3.2 对细菌胞外核酸相对含量的影响

由图10可知，金莲花口服液、金莲花片、金莲花胶囊、金莲花颗粒作用后，培养液中SA的胞外核酸相对含量逐渐增加，表示细菌的细胞膜遭到破坏，因为细胞膜是细菌的保护屏障之一，当药液与细菌直接接触作用后细菌遭到破坏，细胞膜的通透性发生改变，可能使正常状态下在细菌细胞中的DNA、RNA等大分子物质穿过细胞膜泄漏到培养液中，导致培养液在260 nm处的吸光度值增大，即胞外核酸相对含量增大。

3.3.3 对细菌胞外可溶性蛋白的影响

由图11可见，4种金莲花制剂分别作用后，各试验组培养液中的胞外可溶性蛋白含量均显著增加，说明金莲花系列制剂可以通过改变细胞膜的通透性使胞内的蛋白质大分子通过细胞膜泄漏到细胞外，培养液中胞外可溶性蛋白含量增加导致在595 nm处的吸光度增大，这一结果与上述4种金莲花制剂对金黄色葡萄球菌胞外核酸相对含量的测定结果相似，进一步说明了金莲花系列制剂可以影响细菌的细胞膜通透性，对细菌造成一定的破坏，导致细胞内的大分子物质穿过细胞膜泄漏到胞外，从而达到抑菌效果。

4 结论

本研究通过牛津杯法得到4种金莲花制剂对3种致病菌的抑菌活性从强到弱为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌。通过96孔板法得出4种金莲花制剂对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）各不相同，按由强到弱为胶囊、口服液、片、颗粒。说明在相同生药量情况下，制备工艺的不同会对金莲花本身抑菌的效果产生差异性影响，与本课题组前期研究结果相同[6]。

在对金莲花系列制剂主要起作用的金黄色葡萄球菌的作用机制研究中，实验通过细菌生长曲线得到4种金莲花制剂作用后的SA与空白组相比生长速度均显著减缓，说明4种金莲花制剂对金黄色葡萄球菌均有良好的抑制作用。胞外核酸相对含量与胞外可溶性蛋白的测定结果相似，且随着4种金莲花制剂质量浓度的增加，细菌胞外核酸相对含量和胞外可溶性蛋白含量均逐渐增加，在抑菌作用机制研究中发现，金莲花系列制剂作用后，细菌的细胞膜通透性被影响，导致细菌胞内维持生命体征的代谢物质外流或对细菌有害的药液内流，进而影响细菌的生长，达到抑菌效果[7]，且在金莲花等中药材抗菌过程中是否还存在其他抑菌作用机制，如影响细胞壁、菌体结构、蛋白和核酸的合成等，还需要进一步深入研究[9-10]。

5 讨论

金莲花系列制剂收载于《中国药典》2020年版一部中，制备工艺参数不同，质量标准有异，但其标识的功效却完全相同，需对其合理性进行再评价研究。目前，现有的质量再评价主要包括薄层鉴别、含量测定、指纹图谱等方法，不能真实地表征其药物的临床属性。本研究采用抑菌作用机制对四种制剂进行再评价研究，从细菌的生长曲线、胞外核酸相对含量和胞外可溶性蛋白的测定等方面评价其质量，通过抗菌活性和其抑菌作用机制的对比，可为具有抗菌活性的中成药系列制剂的再评价提供参考。

在实验过程经过预试验发现辅料均不影响细菌生长的物质，因此在正式实验中未考察辅料的影响，本研究结果表明金莲花胶囊和金莲花口服液的抑菌活性明显强于金莲花片和金莲花颗粒，一定程度上证明不同的制备工艺会对其抑菌活性造成影响，可能导致各制剂的临床疗效不同，由于4种制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制相同，表明其活性成分相差不大。后期实验将通过LC-MS技术进行高通量筛选明确化学成分，确定早期干预靶点，筛选作用于药效物质基础[11-13]；开展生物活性检定，确定质量标志物，研究其量效关系，为下一步化学评价指标的选择提供参考，从而进一步全面评价4种金莲花制剂的质量[14-15]。

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