枯草芽孢杆菌NCD-2与化学杀菌剂复配对棉花黄萎病的防治效果

郑德有 左东云 吕丽敏 王巧莲 程海亮 顾爱星 宋国立

摘要：【目的】研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2与化学杀菌剂复配对棉花黄萎病的防治效果，为防治棉花黄萎病提供理论依据。【方法】以棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）强致病力菌株Vd080为研究对象，采用生长速率法测定戊唑醇、氟啶胺、咪鲜胺、代森锰锌和百菌清这5种杀菌剂的毒力；用对峙培养法测定NCD-2对Vd080的毒力；筛选出与NCD-2相容性好的杀菌剂，进一步采用Horsfall法确定菌药复配比例；在室内开展盆栽试验，评价不同复配处理对棉花黄萎病的防治效果（防效）。【结果】5种杀菌剂中咪鲜胺对Vd080的抑制效果最好，其有效中浓度为0.027 mg·L^－1，戊唑醇和氟啶胺的抑制效果次之。NCD-2对Vd080的有效抑制中浓度为2.56×10⁷mL^－1（菌体浓度，后同）。0.4 mg·L^－1氟啶胺与2.56×10⁷mL^－1NCD-2的相容性最好，达到79.19%；2.0 mg·L^－1氟啶胺、0.02 mg·L^－1咪鲜胺次之，二者与2.56×10⁷mL^－1NCD-2的相容性分别为71.29%和63.20%。2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺、2.0 mg·L^－1氟啶胺和0.02 mg·L^－1咪鲜胺分别按照体积比3∶7、9∶1和1∶1进行复配时，增效作用最强，对Vd080的抑菌效果最好。室内盆栽试验发现，2.56×10⁷mL^－1枯草芽孢杆菌NCD-2与0.02 mg·L^－1咪鲜胺按体积比1∶1复配时，棉花黄萎病病情指数最低，防效最好（82.81%），具有很好的增效作用（增效系数为23.46）。【结论】2.56×10⁷mL^－1枯草芽孢杆菌NCD-2与0.02 mg·L^－1咪鲜胺按体积比1∶1复配对棉花黄萎病有很好的防治效果，且具有明显的增效作用。

关键词：棉花；黄萎病；枯草芽孢杆菌；杀菌剂；协同防治

Control effects of combination of Bacillus subtilis NCD-2 and chemical fungicides on cotton Verticillium wilt

Zheng Deyou1， 2， Zuo Dongyun1， Lü Limin1， Wang Qiaolian1， Cheng Hailiang1， Gu Aixing2， Song Guoli1*

（1. Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Laboratory of Cotton Bio-breeding and Integrated Utilization， Anyang， Henan 455000， China; 2. College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University/Engineering Research Centre of Cotton， Ministry of Education， Urumqi 830052， China）

Abstract： [Objective] This research aims to study the effects of the combination of Bacillus subtilis NCD-2 and chemical fungicides on the control of cotton Verticillium wilt， so as to provide a theoretical basis for the control of cotton Verticillium wilt. [Methods] The virulent Verticillium dahliae strain Vd080， a pathogen causing cotton Verticillium wilt was used as the object， and the virulence of 5 fungicides （tebuconazole， fluazinam， prochloraz， mancozeb and chlorothalonil） were determined by growth rate method. The toxicity of NCD-2 to Vd080 was determined by dual-culture method. The fungicides with better compatibility with NCD-2 were selected， and the volume ratio of fungicides and NCD-2 was further determined by Horsfall method. The control effects on cotton Verticillium wilt of different compound treatments were evaluated in the indoor pot experiment. [Results] Among the 5 fungicides， prochloraz had the best inhibitory effect on Vd080， and its median effective concentration （EC₅₀） was 0.027 mg·L^-1， followed by tebuconazole and fluazinam. The EC₅₀of NCD-2 to Vd080 is 2.56 × 10⁷mL^-1（cell concentration）. The compatibility of 0.4 mg·L^-1fluazinam with 2.56 × 10⁷mL^-1NCD-2 was best， reaching 79.19%. The compatibility of 2.0 mg·L^-1fluazinam and 0.02 mg·L^-1prochloraz with 2.56 × 10⁷mL^-1NCD-2 were 71.29% and 63.20%， respectively. The synergistic effect of 2.56 × 10⁷mL^-1NCD-2 was the strongest when mixed with 0.4 mg·L^-1fluazinam， 2.0 mg·L^-1fluazinam， and 0.02 mg·L^-1prochloraz at the volume ratios of 3∶7， 9∶1 and 1∶1， respectively， and the inhibitory effect on Vd080 was the best. The indoor pot experiment showed that when 2.56 × 10⁷mL^-1Bacillus subtilis NCD-2 and 0.02 mg·L^-1prochloraz were mixed at the volume ratio of 1∶1， the disease index of cotton Verticillium wilt was the lowest， the control effect was the best （82.81%）， and the synergistic effect was good （synergistic coefficient was 23.46）. [Conclusion] The combination of 2.56 × 10⁷mL^-1Bacillus subtilis NCD-2 and 0.02 mg·L^-1prochloraz at the volume ratio of 1∶1 has a good control effect on cotton Verticillium wilt， and good synergistic effect.

Keywords： cotton; Verticillium wilt; Bacillus subtilis; fungicide; synergistic control

棉花黄萎病（Verticillium wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的维管束病害^[1]，是棉花毁灭性病害之一，在世界各棉花种植区普遍发生^[2]。棉花黄萎病引起棉花叶片失绿黄化，维管束褐化，严重时可造成棉株死亡，给棉花生产造成严重损失^[3-4]。现阶段防治棉花黄萎病仍以化学方法为主，但长期施用杀菌剂会使病原菌产生抗药性，且易造成环境污染^[5]。因此，筛选高效、低毒、与生防菌相容性好的杀菌剂，开展生物-化学协同防治研究，对有效防治棉花黄萎病及棉花产业的可持续发展具有重要意义。

Kattan等^[6]提出用化学药物弱化病原菌的致病性有利于生防菌的定殖，并以此作为植物病害综合防治的一个重要方法。芽孢杆菌属于生防菌，对多种植物病原物具有拮抗效应，且可以在低剂量杀菌剂下正常生长，可与杀菌剂结合防治植物病害^[7]。曾艳玲等^[8]研究发现多菌灵与解淀粉芽孢杆菌联用防治栾树枝枯病的效果显著优于单剂。赵莹莹等^[9]用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KXZ-33与化学药剂协同防控棉花枯萎病，发现甲基硫菌灵与KXZ-33联合使用可有效提高对棉花枯萎病的防治效果（防效）。李社增等^[10]筛选并鉴定出枯草芽孢杆菌NCD-2，研究人员进一步研究发现NCD-2可以在棉花根际快速定殖^[11]，并分泌抗菌蛋白，对棉花黄萎病具有很好的防效^[12]，通过比较5种杀菌剂对NCD-2菌体及芽孢的影响，发现NCD-2可以与杀菌剂混合使用^[13]。

鉴于此，本研究采用室内毒力测定和生物相容性测定方法筛选出对大丽轮枝菌毒力强、与NCD-2相容性好的杀菌剂与NCD-2进行复配，并筛选出最佳复配比例，进一步通过室内盆栽试验测定复配剂对棉花黄萎病的防效，筛选出可稳定防治棉花黄萎病的生防菌与杀菌剂组合，为棉花黄萎病的有效防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试棉花材料。试验所用陆地棉（Gossy-pium hirsutum）品种为中棉所12，种子由国家棉花种质资源中期库（安阳）提供。

1.1.2 供试菌种。供试病原菌为大丽轮枝菌Vd080，为强致病力菌株，由中国农业科学院棉花研究所（中棉所）棉花病害实验室分离、保存。供试枯草芽孢杆菌NCD-2由中棉所棉花病害实验室提供。

1.1.3 供试药剂。80%（质量分数，下同）戊唑醇可湿性粉剂，由浙江威尔达化工有限公司生产；98%氟啶胺原药，由山东潍坊润丰化工股份有限公司生产；97%咪鲜胺原药，由山东华阳农药化工集团有限公司生产；80%代森锰锌可湿性粉剂，由河北中天邦正生物科技股份公司生产；75%百菌清可湿性粉剂，由浙江威尔达化工有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 供试药剂的毒力测定。采用菌丝生长速率法测定5种药剂对病原菌的室内毒力。参照李海薇等^[14]的试验方法，配制含不同质量浓度（0、0.625、1.25、2.5、5、12.5、25、50 mg·L^－1）供试药剂的马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar， PDA）培养基，接入直径为5 mm的Vd080菌饼，25 ℃恒温倒置培养7 d，然后测量菌落直径，并计算抑制率（I）。

I＝[（D₁－5）－（D₂－5）]/（D₁－5）×100% （1）

式中，D₁为空白对照中菌落的直径（mm），D₂为含有供试药剂的PDA培养基中菌落直径（mm）。

根据檀根甲等[15]的方法，将药剂质量浓度以10为底的对数值（x）与对应抑制率的概率值（y）作回归分析，得到毒力回归方程，计算回归直线的决定系数（determination coefficient， R²），并计算出供试药剂对黄萎病菌的有效中浓度（median effective concentration， EC_50，mg·L^－1）：

y＝a＋bx                                                    （2）

式中，a代表回归直线在y轴上的截距，b为计算EC₅₀的中间量，其绝对值为回归直线的斜率。

1.2.2 NCD-2对Vd080的毒力测定。挑取NCD-2单菌落接入1 mL Luria-Bertani（LB）液体培养基中，于37 ℃培养12 h，配制菌体浓度分别为1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹mL^－1的枯草芽孢杆菌NCD-2菌液。采用平板对峙法中的滤纸片法^[16]测定NCD-2对Vd080的室内毒力。用十字交叉法测量Vd080菌落直径，按照1.2.1的方法计算其平均抑制率、回归方程、R²和EC₅₀。

1.2.3 杀菌剂与NCD-2的相容性。将菌体浓度为1×10⁵mL^－1的枯草芽孢杆菌NCD-2的菌液中分别加入含有0.02 mg·L^－1及0.07 mg·L^－1咪鲜胺、0.1 mg·L^－1及0.5 mg·L^－1戊唑醇、0.4 mg·L^－1及2.0 mg·L^－1氟啶胺的LB液体培养基中。每个处理3次重复，以未加入杀菌剂的LB液体培养基作为空白对照。28 ℃、150 r·min^－1振荡培养24 h后，将培养液梯度稀释至1×10^－6、1×10^－7、1×10^－8，采用平板计数法统计NCD-2活菌数量，用药剂处理下的活菌数与空白对照处理的活菌数的比值表示相容性，筛选出与枯草芽孢杆菌NCD-2相容性较好的化学药剂。

1.2.4 复配剂对Vd080的毒力测定。根据单剂的毒力测定结果，选取对Vd080抑制效果较好且与NCD-2相容性较好的2种杀菌剂进行复配。以单剂EC₅₀为基础，配制单剂的有效中浓度药液和NCD-2菌液，并将NCD-2菌液与杀菌剂分别按体积比0∶10、1∶9、1∶4、3∶7、2∶3、1∶1、3∶2、7∶3、4∶1、9∶1和10∶0进行复配^[17]。采用菌丝生长速率法，将以上不同配比的复配剂分别配制成PDA固体培养基，以加入等量无菌水的培养基为空白对照，将Vd080菌饼（直径6 mm）接入培养基，每个处理设3次重复，置于28 ℃恒温培养箱中培养。待对照菌落生长至占培养皿的1/2～2/3时，采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算抑制率（参照1.2.1的计算方法）。采用Horsfall法进行联合毒力增效的计算^[18]。

E_th＝I₁×V₁＋I₂×V₂（3）

式中，E_th为复配剂的理论防效，即复配剂对Vd080的理论抑制率，I₁为NCD-2对Vd080的抑制率，V₁为混剂中NCD-2所占体积比，I₂为杀菌剂对Vd080的抑制率，V₂为混剂中杀菌剂所占体积比^[19]。

I_R＝E_ab/E_th（4）

式中，I_R为增效比率，E_ab为复配剂的实际防效，即复配剂对Vd080的抑制率。根据I_R值判断不同配方的协同作用效果。I_R＞1表示增效作用；I_R＝1表示加和作用；I_R＜1表示拮抗作用^[20]。

1.2.5 温室试验测定菌药复配剂对棉花黄萎病的防效。采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法^[21]进行棉苗培育和病原菌的接种。每钵播种3粒棉种，出苗后留苗1株；每10个营养钵为1个处理，每个处理重复3次。在棉苗两叶一心期进行药剂处理，在施药后15 d左右观察发病情况，调查病情指数，统计防效和增效系数。棉花苗期黄萎病的分级、病情指数和防效计算均参照国家标准《棉花抗病虫性评价技术规范 第5部分：黄萎病》（GB/T 22101.5－2009）^[22]。采用Mansour等^[23]的二元混剂等毒法进行增效作用的判定。

假设混用的药剂（菌液）分别为A和B，单用防效分别以百分数表示为C_a和C_b，混用的实际防效为C_S，A、B混用的理论防效（C₁）和增效系数（C_TC）计算公式如下，

C₁＝C_a＋（1－C_a）×C_b（5）

C_TC＝（C_S－C₁）×100      （6）

式中，C_TC≥20表示增效作用，C_TC≤－20表示拮抗作用，－20＜C_TC＜20表示相加作用。

1.3 数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 20.0软件进行整理和统计分析，通过回归分析计算室内毒力回归方程；病情指数和防效经过描述性统计后进行正态性检验，均符合正态分布，然后采用单因素方差分析和最小显著差数法（least significant difference， LSD）进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 单剂室内毒力测定

2.1.1 5种杀菌剂对Vd080的室内毒力测定。试验结果（表1）表明，咪鲜胺、戊唑醇、氟啶胺、百菌清和代森锰锌这5种杀菌剂对大丽轮枝菌Vd080均有一定的抑制作用。其中咪鲜胺对病原菌Vd080的毒力最强，戊唑醇、氟啶胺次之，且三者的EC₅₀都小于0.5 mg·L^－1；百菌清和代森锰锌对Vd080的毒力较差，二者的EC₅₀都高于3 mg·L^－1。

2.1.2 NCD-2对Vd080的毒力测定。通过对峙培养法测定枯草芽孢杆菌NCD-2对大丽轮枝菌Vd080的室内毒力。试验结果（表2）显示，随着浓度的增加，NCD-2对Vd080的抑制率逐渐升高。毒力回归方程为y＝0.300x－2.222，R²为0.949，NCD-2对Vd080的EC₅₀为2.56×10⁷mL^－1。

2.2 杀菌剂对NCD-2的影响

根据上述5种杀菌剂对Vd080的室内毒力测定结果，选取毒力较强的咪鲜胺、戊唑醇和氟啶胺，进一步研究其对生防菌NCD-2的影响。依据室内毒力测定所得EC₅₀和EC₇₅（抑制率75%时的药剂浓度）的近似浓度，共设置6个处理（0.02 mg·L^－1、0.07 mg·L^－1的咪鲜胺；0.1 mg·L^－1、0.5 mg·L^－1的戊唑醇；0.4 mg·L^－1、2.0 mg·L^－1的氟啶胺）以及空白对照（CK）。试验结果（图1）显示，枯草芽孢杆菌NCD-2在LB液体培养基中培养24 h后，CK处理的活菌数为5.19×10⁷mL^－1，显著高于其余处理；0.4 mg·L^－1氟啶胺与NCD-2的相容性最好，活菌数为4.11×10⁷mL^－1，相容性达到79.19%。2.0 mg·L^－1氟啶胺、0.02 mg·L^－1咪鲜胺与NCD-2的相容性次之，活菌数分别为3.70×10⁷mL^－1和3.28×10⁷mL^－1，相容性分别为71.29%和63.20%；0.5 mg·L^－1戊唑醇与NCD-2的相容性最差，仅为8.86%，其活菌数显著低于其余处理。

2.3 复配剂对大丽轮枝菌Vd080的毒力测定

根据以上试验结果，将菌体浓度为2.56×10⁷mL^－1的NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺、2.0 mg·L^－1氟啶胺和0.02 mg·L^－1咪鲜胺按照不同体积比进行复配，进行室内联合毒力测定。结果（表3）显示，NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺分别按体积比9∶1、7∶3、3∶2、1∶1和3∶7进行复配对Vd080的抑制具有明显增效作用（I_R＞1），其中体积比为3∶7时I_R为1.66，实际抑菌率为93.27%，显著高于其余体积比处理下的抑菌率，增效作用最强，抑菌作用效果最好。因此3∶7为2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺的最佳复配比例。

2.56×10⁷mL^－1NCD-2与2.0 mg·L^－1氟啶胺分别按体积比9∶1、4∶1和3∶2进行复配对Vd080的抑制具有明显增效作用（I_R＞1），其中体积比为9∶1时I_R为1.39，实际抑菌率为96.22%，显著高于其余体积比处理下的抑菌率，增效作用最强，抑菌作用效果最好。因此，9∶1为2.56×10⁷mL^－1NCD-2与2.0 mg·L^－1氟啶胺的最佳复配比例。

2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.02 mg·L^－1咪鲜胺分别按体积比4∶1、7∶3、3∶2、1∶1和3∶7进行复配时，对Vd080的抑制具有明显增效作用（I_R＞1），其中体积比为1∶1时I_R为1.36，实际抑菌率为94.67%，显著高于其余体积比处理下的抑菌率，增效作用最强，抑菌作用效果最好。因此，1∶1为2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.02 mg·L^－1咪鲜胺的最佳复配比例。

2.4 复配剂室内防效测定

室内防效测定结果（表4）显示，3种复配组合（2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺、2.0 mg·L^－1氟啶胺和0.02 mg·L^－1咪鲜胺分别按体积比3∶7 、9∶1和1∶1复配）中，2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.02 mg·L^－1咪鲜胺按体积比1∶1复配的效果最好，对棉花黄萎病的防效可达82.81%，显著高于其他药剂或菌药复配处理，其增效系数为23.46（＞20），具有很好的增效作用；该处理下棉花的病情指数显著低于其余处理。2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺按体积比3∶7复配的防效（51.56%）次之，增效系数为－11.40，表明二者具有相加作用。2.56×10⁷mL^－1NCD-2与2.0 mg·L^－1氟啶胺按体积比9∶1复配的防效较差（35.94%），低于单剂的防效，增效系数为－34.25（＜－20），表明二者具有很强的拮抗作用。

3 讨论

黄萎病是棉花生产中的毁灭性病害之一，很难根治，严重威胁棉花产业的可持续发展^[24]。枯草芽孢杆菌具有耐受性强、繁殖快、分布广等特点，在防治棉花黄萎病方面发挥重要作用。李社增等^[10]利用枯草芽孢杆菌NCD-2防治棉花黄萎病，发现其具有很好的防效，并且能改善棉花的纤维品质。李海涛等^[25]利用枯草芽孢杆菌Jaas ed1防治棉花黄萎病，结果显示其在有效防治黄萎病的同时还可促进棉花生长发育，提高棉花产量。虽然枯草芽孢杆菌已广泛应用于防治棉花黄萎病，但目前关于菌药协同防治的研究报道较少，生物-化学协同防治策略在指导棉花黄萎病有效防治方面具有重大意义。

本研究通过5种化学杀菌剂咪鲜胺、戊唑醇、氟啶胺、百菌清和代森锰锌对大丽轮枝菌Vd080的毒力测定表明，咪鲜胺对大丽轮枝菌Vd080的抑制效果最好，戊唑醇和氟啶胺次之；代森锰锌与百菌清抑制效果较差。这与农业生产中常使用咪鲜胺、戊唑醇等咪唑类及三唑类杀菌剂防治棉花黄萎病的情况相符。通过研究化学杀菌剂咪鲜胺、戊唑醇、氟啶胺、百菌清和代森锰锌对NCD-2的毒力，发现氟啶胺、咪鲜胺与生防菌NCD-2的相容性均较好。其中，在较高浓度氟啶胺下，NCD-2仍能正常生长，且无明显抑制作用；这与鹿秀云等^[13]的研究结果相符。本研究通过室内毒力测定及相容性测定，最终选用氟啶胺和咪鲜胺分别与NCD-2混配。

利用生防微生物与化学药剂协同防治植物病害具有明显的增效作用，近年来采用生物与化学药剂协同防治植物土传病害的相关研究报道较多^[26-27]，但应用于防治棉花黄萎病的研究报道还较少^[28]。本研究突破以化学药剂为主防治棉花黄萎病的局限性，利用生防微生物与低毒化学药剂协同防治棉花黄萎病。2.56×10⁷mL^－1枯草芽孢杆菌NCD-2与0.4 mg·L^－1氟啶胺、2.0 mg·L^－1氟啶胺和0.02 mg·L^－1咪鲜胺分别按体积比3∶7、9∶1和1∶1进行复配时对大丽轮枝菌Vd080具有很好的抑制效果，且具有明显的增效作用。盆栽试验表明，2.56×10⁷mL^－1NCD-2与0.02 mg·L^－1咪鲜胺按体积比1∶1进行复配时对棉花黄萎病的防治效果最佳，防效可达82.81%，且增效作用明显。

本研究采用生物防治与化学防治相结合的策略，在有效提高棉花黄萎病防效的同时减少了杀菌剂使用量，利于延缓病原菌对杀菌剂的抗药性^[29]。化学药剂能降低习居微生物（包括病原菌）对生防微生物的排斥作用，使生防微生物能顺利定殖、生长，并逐步发展成为优势微生物，更好地发挥生物防治作用^[30]，弥补生防菌防效缓慢和易受环境影响的不足^[31]，通过菌药复配的协同作用可达到菌药优势互补、化学农药用量减少、防效增加的目的^[32]。

4 结论

化学杀菌剂咪鲜胺、戊唑醇、氟啶胺和生防菌枯草芽孢杆菌NCD-2对大丽轮枝菌Vd080均具有良好的抑制效果，可用于棉花黄萎病的防治。枯草芽孢杆菌NCD-2在较高浓度下的氟啶胺、咪鲜胺溶液中仍能正常生长，可复配使用。枯草芽孢杆菌NCD-2（菌数为2.56×10⁷mL^－1）与0.02 mg·L^－1咪鲜胺按体积比1∶1进行复配时对棉花黄萎病的防效最佳，增效作用明显，具有开发成菌药制剂的潜力，用于生产中棉花黄萎病的防治。

参考文献：

[1] Tao X Y， Zhang H L， Gao M T， et al. Pseudomonas species isolated via high-throughput screening significantly protect cotton plants against Verticillium wilt[J/OL]. AMB Express， 2020， 10： 193[2022-09-15]. https：//doi.org/10.1186/s13568-020-01132-1.

[2] Tian J， Zhang X Y， Liang B G， et al. Expression of baculovirus anti-apoptotic genes p35 and op-iap in cotton （Gossypium hirsutum L.） enhances tolerance to Verticillium wilt[J/OL]. PLoS ONE， 2010， 5（12）： e14218[2022-09-15]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0014218.

[3] 沈其益. 棉花病害基础研究与防治[M]. 北京： 科学出版社， 1992.

Shen Qiyi. Cotton diseases-basic research and control[M]. Beijing： Science Press， 1992.

[4] Dong Q， Magwanga R O， Cai X Y， et al. RNA-sequencing， physiological and RNAi analyses provide insights into the response mechanism of the ABC-mediated resistance to Vertici-llium dahliae infection in cotton[J/OL]. Genes， 2019， 10（2）： 110[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3390/genes10020110.

[5] 陈丽华， 何鹏飞， 袁德超， 等. 一种防治棉花黄萎病的生物复合种衣剂的研制[J/OL]. 棉花学报， 2018， 30（3）： 282-291[2022-09-15]. https：//doi.org/10.11963/1002-7807.clhhyq.20180509.

Chen Lihua， He Pengfei， Yuan Dechao， et al. Development of a biological complex seed-coating agent to control Verticillium wilt[J/OL]. Cotton Science， 2018， 30（3）： 282-291[2022-09-15]. https：//doi.org/10.11963/1002-7807.clhhyq.20180509.

[6] Katan J， Ginzburg C， Assaraf M. Pathogen weakening as a component of integrated control[J]. Advances in Biological Control of Plant Diseases， 1996， 18（2）： 320-326.

[7] 黄慧婧， 罗坤. 芽孢杆菌与杀菌剂复配防治植物病害的研究进展[J/OL]. 微生物学通报， 2021， 48（3）： 938-947[2022-09-15]. https：//doi.org/10.13344/j.microbiol.china.200444.

Huang Huijing， Luo Kun. Research progress in the control of plant diseases by the combination of Bacillus and fungicides[J/OL]. Microbiology China， 2021， 48（3）： 938-947[2022-09-15]. https：//doi.org/10.13344/j.microbiol.china.200444.

[8] 曾艳玲， 刘韩， 黎肇家， 等. 生防芽孢杆菌与杀菌剂的筛选复配及对栾树枝枯病防控效果[J/OL]. 四川农业大学学报， 2021， 39（1）： 55-62[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16036/j.issn.1000-2650.2021.01.009.

Zeng Yanling， Liu Han， Li Zhaojia， et al. Screening and compounding of biocontrol Bacillus and fungicide and their control effect on branch withered disease on Koelreuteria paniculata[J/OL]. Journal of Sichuan Agricultural University， 2021， 39（1）： 55-62[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16036/j.issn.1000-2650.2021.01.009.

[9] 赵莹莹， 张军高， 李进， 等. 枯草芽孢杆菌KXZ-33与化学药剂协同防控棉花黄萎病的效果评价[J/OL]. 新疆农业科学， 2022， 59（5）： 1216-1222[2022-09-15]. https：//doi.org/10.6048/j.issn.1001-4330.2022.05.021.

Zhao Yingying， Zhang Jungao， Li Jin， et al. Preliminary study on the synergistic effects of Bacillus subtilis KXZ-33 and chemical pesticides against cotton Fusarium wilt[J/OL]. Xinjiang Agricultural Sciences， 2022， 59（5）： 1216-1222[2022-09-15]. https：//doi.org/10.6048/j.issn.1001-4330.2022.05.021.

[10] 李社增， 鹿秀云， 马平， 等. 防治棉花黄萎病的生防细菌NCD-2的田间效果评价及其鉴定[J]. 植物病理学报， 2005， 35（5）： 451-455.

Li Shezeng， Lu Xiuyun， Ma Ping， et al. Evaluation of biocontrol potential of a bacterial strain NCD-2 against cotton Verticillium wilt in field trials[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2005， 35（5）： 451-455.

[11] 董丽红， 郭庆港， 张晓云， 等. 棉花根系分泌物对枯草芽胞杆菌NCD-2生物膜形成和根际定殖的影响[J/OL]. 植物病理学报， 2015， 45（5）： 541-547[2023-02-26]. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2015.05.012.

Dong Lihong， Guo Qinggang， Zhang Xiaoyun， et al. Effects of cotton root exudates on the biofilm formation and root colonization of Bacillus subtilis strain NCD-2[J/OL]. Acta Phytopathologica Sinica， 2015， 45（5）： 541-547[2023-02-26]. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2015.05.012.

[12] 张晓云， 郭庆港， 鹿秀云， 等. 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌蛋白的分离及鉴定[J/OL]. 植物病理学报， 2018， 48（3）： 395-401[2023-02-26]. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.00223.

Zhang Xiaoyun， Guo Qinggang， Lu Xiuyun， et al. Isolation and identification of an antifungal protein produced by Bacillus subtilis NCD-2[J/OL]. Acta Phytopathologica Sinica， 2018， 48（3）： 395-401[2023-02-26]. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.00223.

[13] 鹿秀云， 李社增， 高胜国， 等. 5种化学杀菌剂对枯草芽孢杆菌NCD-2菌体及芽孢的影响[J/OL]. 植物病理学报， 2005（S1）： 173-175[2023-02-26]. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2005.s1048.

Lu Xiuyun， Li Shezeng， Gao Shengguo， et al. Effect of 5 che-mical fungicides on thallus and spore of Bacillus subtilis NCD-2[J/OL]. Acta Phytopathologica Sinica， 2005（S1）：173-175[2023-02-26].  https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2005.s1048.

[14] 李海薇， 侯仙， 王梦瑶， 等. 海岛棉黄萎病病原菌分离及室内药剂筛选[J]. 中国农学通报， 2019， 35（9）： 68-74.

Li Haiwei， Hou Xian， Wang Mengyao， et al. Pathogen isolation of Fusarium wilt of island cotton and indoor fungicides screening[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2019， 35（9）： 68-74.

[15] 檀根甲， 祝建平. 杀菌剂生物测定计算方法及应用[J]. 安徽农学通报， 1998（1）： 28-29.

Tan Genjia， Zhu Jianping. Fungicide bioassay computational methods and applications[J]. Anhui Agricultural Science Bu-lletin， 1998（1）： 28-29.

[16] 吴炜城， 陈必婷， 张世清， 等. 海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究[J/OL]. 热带作物学报， 2022， 43（6）： 1240-1247[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.017.

Wu Weicheng， Chen Biting， Zhang Shiqing， et al. Isolation and identification of symbiotic actinomycetes from termites in Hainan and their activity against tropical plants pathogenic fungi[J/OL]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2022， 43（6）： 1240-1247[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.017.

[17] 谢立， 贺春萍， 梁艳琼， 等. 枯草芽孢杆菌Czk1与化学杀菌剂协同防治橡胶树根病[J/OL]. 热带作物学报， 2020， 41（8）： 1625-1633[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.017.

Xie Li， He Chunping， Liang Yanqiong， et al. Synergistic effect of fungicides and Bacillus subtilis Czk1 against rubber root diseases[J/OL]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2020， 41（8）： 1625-1633[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.017.

[18] 陈福良， 郑斐能， 王仪. 农药混配室内毒力测定的一种实验技术[J]. 农药科学与管理， 1997（4）： 30-31， 34.

Chen Fuliang， Zheng Feineng， Wang Yi. A trial design about bioassay of insecticide mixed[J]. Pesticide Science and Admi-nistration， 1997（4）： 30-31， 34.

[19] 谷春艳， 苏贤岩， 杨雪， 等. 解淀粉芽胞杆菌WH1G与咪鲜胺协同防治草莓炭疽病[J/OL]. 植物保护， 2018， 44（2）： 184-189， 226[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16688/j.zwbh.2017209.

Gu Chunyan， Su Xianyan， Yang Xue， et al. Synergistic effect of antagonistic bacteria WH1G and prochloraz against strawberry anthracnose[J/OL]. Plant Protection， 2018， 44（2）： 184-189， 226[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16688/j.zwbh.2017209.

[20] 冯永新， 关辉， 靳彦峰， 等. 短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂协同防治烟草青枯病研究[J/OL]. 中国烟草科学， 2021， 42（4）： 44-49[2022-09-15]. https：//doi.org/10.13496/j.issn.1007-5119.2021.04.007.

Feng Yongxin， Guan Hui， Jin Yanfeng， et al. Synergistic control effect of Bacillus pumilus AR03 and fungicides against tobacco bacterial wilt[J/OL]. Chinese Tobacco Science， 2021， 42（4）： 44-49[2022-09-15]. https：//doi.org/10.13496/j.issn.1007-5119.2021.04.007.

[21] 朱荷琴， 冯自力， 李志芳， 等. 蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法鉴定棉花品种（系）的抗黄萎病性[J/OL]. 中国棉花， 2010， 37（12）： 15-17[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1000-632X.2010.12.006.

Zhu Heqin， Feng Zili， Li Zhifang， et al. Dip quantitative fungal solution method by using vermiculite sand without bottom paper bowl to identify cotton varieties （lines） of resistance to Verticillium wilt[J/OL]. China Cotton， 2010， 37（12）： 15-17[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1000-632X.2010.12.006.

[22] 中华人民共和国农业农村部. 棉花抗病虫性评价技术规范 第5部分： 黄萎病： GB/T 22101.5—2009[S]. 北京： 中国标准出版社， 2009.

Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People's Republic of China. Technical specification for evaluating resistance of cotton to diseases and insect pests-part 5： Verticillium wilt： GB/T 22101.5—2009[S]. Beijing： China Standards Press， 2009.

[23] Mansour N A， Eldefrawi M E， Toppozada A， et al. Toxicological studies on the Egyptian cotton leaf worm， Prodenia litura.VI. Potentiation and antagonism of organophosphorus and carbamate insecticides[J/OL]. Journal of Economic Entomology， 1966， 59（2）： 307-311[2022-09-15]. https：//doi.org/10.1093/jee/59.2.307.

[24] 李全胜， 张国丽， 吕宁， 等. 棉花黄萎病生防芽孢杆菌S12产芽孢培养基的响应面优化[J/OL]. 西北农业学报， 2018， 27（10）： 1526-1536[2022-09-15]. https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2018.10.017.

Li Quansheng， Zhang Guoli， Lü Ning， et al. Optimization of culture medium for spore production from a biocontrol spore bacterium S12 against cotton Verticillium wilt by using response surface methodology[J/OL]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica， 2018， 27（10）： 1526-1536[2022-09-15]. https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2018.10.017.

[25] 李海涛， 李素霞， 胡玉新， 等. 枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌剂对棉花黄萎病的防效研究[J/OL]. 棉花科学， 2019， 41（1）： 31-33[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.2095-3143.2019.01.007.

Li Haitao， Li Suxia， Hu Yuxin， et al. Efficacy of Bacillus subtilis Jaas ed1 fungicide against cotton Verticillium wilt[J/OL]. Cotton Sciences， 2019， 41（1）： 31-33[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.2095-3143.2019.01.007.

[26] 黄小琴， 刘勇， 张蕾， 等. 烟草青枯病生防芽孢杆菌协同防治药剂的筛选和复配[J/OL]. 农药， 2015， 54（11）： 848-851[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16820/j.cnki.1006-0413.2015.11.021.

Huang Xiaoqin， Liu Yong， Zhang Lei， et al. Screening synergistic bactericide combined with Bacillus against tobacco bacteria wilt[J/OL]. Agrochemicals， 2015， 54（11）： 848-851[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16820/j.cnki.1006-0413.2015.11.021.

[27] 尹建行， 贺春萍， 梁艳琼， 等. 枯草芽孢杆菌Czk1与化学杀菌剂复配对橡胶树炭疽病和白粉病的防效测定[J/OL]. 特产研究， 2023， 45（3）： 65-71[2022-09-15].  https：//doi.org/10.16720/j.cnki. tcyj.2022.091.

Yin Jianhang， He Chunping， Liang Yanqiong， et al. Control effect of Bacillus subtilis Czk1 combined with chemical fungicides against anthracnose and powdery mildew of Hevea brasiliensis[J/OL]. Special Wild Economic Animal and Plant Research， 2023， 45（3）： 65-71[2022-09-15]. https：//doi.org/10.16720/j.cnki.tcyj.2022.091.

[28] 侯仙， 李海薇， 马小龙， 等. 棉花黄萎病拮抗真菌的筛选鉴定及其室内盆栽防效[J]. 新疆农业大学学报， 2018， 41（1）： 42-47.

Hou Xian， Li Haiwei， Ma Xiaolong， et al. Screening， identification and control of antagonistic fungi against Verticillium dahlia in cotton[J]. Journal of Xinjiang Agricultural University， 2018， 41（1）： 42-47.

[29] 陈志谊， 任海英， 刘永锋， 等. 戊唑醇和枯草芽孢杆菌协同作用防治蚕豆枯萎病及增效机理初探[J/OL]. 农药学学报， 2002（4）： 40-44[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3321/j.issn：1008-7303.2002.04.008.

Chen Zhiyi， Ren Haiying， Liu Yongfeng， et al. Synergism between tebuconazole and Bacillus subtilis against Faba bean Fusarium wilt and mechanism of increasing effect[J/OL]. Chinese Journal of Pesticide Science， 2002（4）： 40-44[2022-09-15]. https：//doi.org/10.3321/j.issn：1008-7303.2002.04.008.

[30] 刘晓妹， 王青丽， 付成峰， 等. 芒果炭疽病生防菌诱变选育及与常用农药优化组合筛选[J/OL]. 中国植保导刊， 2013， 33（6）： 16-20[2023-02-26]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1672-6820.2013.06.004.

Liu Xiaomei， Wang Qingli， Fu Chengfeng， et al. Mutation breeding of bio-control bacterium strains and its optimum combination-selecting with common pesticides to mango anthracnose[J/OL]. China Plant Protection， 2013， 33（6）： 16-20[2023-02-26]. https：//doi.org/10.3969/j.issn.1672-6820.2013.06.004.

[31] 邱雪迎， 马丹丹， 赵伟全， 等. 微型薯蛭石基质中疮痂病原鉴定及菌药协同防治探索[J/OL]. 河南农业科学， 2019， 48（3）： 83-89[2022-09-15].  https：//doi.org/10.15933/j.cnki.1004-3268.2019.03.012.

Qiu Xueying， Ma Dandan， Zhao Weiquan， et al. Pathogen identification and synergistic control tests of minituber common scab disease in vermiculite substrate[J/OL]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2019， 48（3）： 83-89[2022-09-15]. https：//doi.org/10.15933/j.cnki.1004-3268. 2019.03.012.

[32] 毕秋艳， 韩秀英， 马志强， 等. 枯草芽胞杆菌HMB-20428与化学杀菌剂互作对葡萄霜霉病菌抑制作用和替代部分化学药剂减量用药应用[J/OL]. 植物保护学报， 2018， 45（6）： 1396-1404[2022-09-15]. https：//doi.org/10.13802/j.cnki.zwbhxb. 2018.2017224.

Bi Qiuyan， Han Xiuying， Ma Zhiqiang， et al. Inhibitory effects of Bacillus subtilis HMB-20428 interacted with chemical fungicides and decrement of chemical fungicides on oomycete pathogen Plasmopara viticola[J/OL]. Journal of Plant Protection， 2018， 45（6）： 1396-1404[2022-09-15]. https：//doi.org/10.13802/j.cnki.zwbhxb.2018.2017224.

（责任编辑：王小璐 责任校对：秦凡）

收稿日期：2022-09-22     第一作者简介：郑德有（1996―），男，硕士研究生，2970836442@qq.com。*通信作者：songguoli@caas.cn

基金项目：国家自然科学基金（31621005）；中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-CCRI）