类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析
2023-04-29高升旗邵武奎赵准邵盘霞胡文冉黄全生
高升旗 邵武奎 赵准 邵盘霞 胡文冉 黄全生
摘要：【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白（calcium B-like protein， CBL）基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能，为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得 GhCBL3-A01基因的同源序列，进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）检测大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、茉莉酸甲酯（methyl jasminate， MeJA）和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量，初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后，GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低，茎秆维管束褐变程度减轻，有病菌繁殖的茎段数量明显减少，增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多，防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性，是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。
关键词：棉花；黄萎病；类钙调磷酸酶B亚基蛋白；GhCBL3-A01；抗病基因；病毒诱导的基因沉默
Functional analysis of cotton calcineurin B-like protein GhCBL3-A01 in regulating the resistance to Verticillium wilt
Gao Shengqi1， 2， Shao Wukui1， 2， Zhao Zhun1， 2， Shao Panxia1， 2， Hu Wenran1， 2， Huang Quansheng1， 2*
[1. Institute of Nuclear Technology and Biotechnology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Xinjiang Key Laboratory of Crop Biotechnology， Urumqi 830091， China; 2. National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Germplasm Innovation in Arid Desert Areas （Preparation）， Urumqi 830091， China]
Abstract： [Objective] This research aims to investigate the role of calcium B-like protein （CBL） gene GhCBL3-A01 in resistance to Verticillium wilt in cotton， so as to provide genetic resource for cotton disease resistance breeding. [Methods] The homologous sequences of GhCBL3-A01 gene were obtained from cotton genomic database for bioinformatic analysis. The relative expression levels of GhCBL3-A01 under Verticillium dahliae， methyl jasminate （MeJA） and H2O2treatments were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The function of GhCBL3-A01 in cotton resistance to Verticillium wilt was analysed by virus-induced gene silencing （VIGS） technique. The functional mechanisms of GhCBL3-A01 were analyzed by detecting the accumulation of reactive oxygen species （ROS） and the expression levels of related genes. [Results] GhCBL3-A01 and its three homologous proteins in upland cotton all contain three typical EF-hand domains of the CBL family. The expression level of GhCBL3-A01 was significantly increased under the treatment of Verticillium dahliae， MeJA， and H2O2. Silencing GhCBL3-A01 by VIGS resulted in a significant decrease in rate of diseased plants and disease index， a reduction in the browning degree of vascular bundles， and a decline in the number of hyphae in stem segments， which enhanced the resistance of cotton plants to Verticillium wilt. The expression levels of disease resistance-related genes （PR1， NPR1， PR4， and PDF1.2） and jasmonic acid （JA） signaling pathway genes （AOS1， OPR3， MYC2， and LOX2） were increased， and ROS accumulation was enriched in GhCBL3-A01 silenced cotton plants. [Conclusion] GhCBL3-A01 negatively regulates the resistance of cotton to Verticillium wilt by regulating the expression levels of defense-related genes and JA signaling pathway genes as well as the accumulation of ROS， which is a candidate gene for improving the resistance of cotton to Verticillium wilt.
Keywords： cotton; Verticillium wilt; calcineurin B-like protein（CBL）; GhCBL3-A01; resistance gene; virus-induced gene silencing
棉花（Gossypium spp.）是纺织工业的天然纤维来源。棉花的生长发育经常受到多种病害的影响，尤其是黄萎病（Verticillium wilt），导致产量和纤维品质严重下降[1-2]。目前，利用杀菌剂无法有效防治棉花黄萎病，最有效的措施是选育抗病品种。因此，鉴定黄萎病抗性基因并解析其作用机制对于培育优质抗病棉花品种至关重要[3]。
近年来，关于棉花对黄萎病菌侵染的防御反应机制取得了新的研究进展，发现几种信号通路（包括植物激素等）能够激活棉花对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的防御反应[4]。已鉴定到一些黄萎病抗性相关基因。如棉花乳胶蛋白基因GhMLP28正调控乙烯响应因子GhERF6，这2个基因编码的蛋白通过协同互作保护棉花免受黄萎病菌的侵染[5]。钙依赖蛋白激酶GhCPK33通过磷酸化12-氧代植二烯酸还原酶GhOPR3负调控棉花对黄萎病菌的抗性，进一步研究发现GhOPR3可直接调控茉莉酸（jasmonic acid， JA）的生物合成，从而提高棉花对黄萎病的抗性[6]。抑制油菜素内酯（brassinosteroid， BR）GhBZR1基因的表达能增强感病陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品系86-1对黄萎病菌的抗性，而超表达GhBZR1降低转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）对黄萎病菌的抗性[7]。陆地棉Rho鸟苷三磷酸酶GhROP6通过参与JA合成、JA信号通路以及木质素合成代谢调控棉花抗黄萎病反应[8]。促丝裂原活化蛋白激酶GhMAPKKK2通过参与JA和水杨酸（salicylic acid， SA）信号通路在棉花抗黄萎病反应中发挥正调控作用[9]。沉默GhMYB43增强棉株对黄萎病菌的抗性，进一步分析发现GhMYB43负调控木质素合成途径中关键酶编码基因和JA信号通路相关基因的转录水平[10] 。此外，利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技术发现，沉默棉花非特异抗性基因GhNDR1和丝裂原活化蛋白激酶的激酶GhMKK2降低了棉花对黄萎病的抗性[11]。沉默棉花病原体相关分子模式调节因子GhBAK1导致细胞死亡，同时产生活性氧（reactive oxygen species， ROS），从而使棉花品系CA4002对黄萎病产生抗性[12]。钙依赖蛋白激酶GhCPK28-A10（Gh_A10G086300）负调控棉花对黄萎病的抗性反应[13]，而且GhCPK28（由Gh_A11G186100编码）可以与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GhPBL9和核糖体蛋白GhRPL12C相互作用，激活调控棉花黄萎病抗性的潜在分子靶点[14]。GhDIR参与木质素的形成，与植物对病原菌的防御反应有关[15]。Sun等[16]利用VIGS技术发现，沉默GhADF6增加了根细胞中肌动蛋白的丰度，增强棉花对大丽轮枝菌的抗性。Zhao等[17]发现，抑制GhRDUF4D基因表达导致植株对黄萎病菌的抗性减弱。然而，目前关于棉花对大丽轮枝菌入侵的防御反应机制尚不十分清楚[18]。
为应对病原菌入侵，植物已进化出两层天然免疫系统，即病原相关分子模式激发的免疫反应（pattern-triggered immunity， PTI）和效应子激发的免疫反应（effector-triggered immunity， ETI）。胞质钙离子（Ca2＋）的变化和ROS的爆发对激活PTI和ETI反应具有重要意义[19]。Ca2＋作为1种重要的次级信使，几乎参与非生物和生物应激反应中细胞信号传导的各个方面[20]。钙调蛋白（calmo-dulin， CaM）、CaM相关蛋白（CaM-related proteins）、钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase， CDPK）和类钙调磷酸酶B亚基蛋白（calcium B-like protein， CBL）是植物中4类主要的Ca2＋传感器[21]。其中，CBL作为1类特殊的Ca2＋传感器，在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。例如，AtCBL1正调控拟南芥对盐和干旱胁迫的响应[22]。AtCBL9不仅影响植株对盐胁迫和甘露醇的反应，还调节渗透胁迫诱导的脱落酸（abscisic acid， ABA）积累[23]。水稻（Oryza sativa）OsCBL8受多种胁迫诱导表达，转基因超表达植株的耐盐性增强[24]。玉米（Zea mays）ZmCBL4参与调控盐胁迫引发的钙信号，从而提高植株对盐胁迫的耐受性[25]。然而，目前关于CBL在防御病原菌入侵方面的研究报道较少。
本课题组前期用黄萎病致病菌V991接种陆地棉标准品系TM-1，以筛选黄萎病抗性相关基因，发现Gh_A01G0740受棉花黄萎病菌强烈诱导。序列比对分析表明，该基因与拟南芥AtCBL3基因高度同源，而且该基因在陆地棉TM-1基因组中共有4个同源序列，将其命名为GhCBL3-A01。基于此，本研究进一步分析了GhCBL3-A01的基因结构、蛋白保守基序和启动子区顺式作用元件，在黄萎病菌、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）以及 H2O2胁迫下的转录水平，然后通过VIGS技术下调GhCBL3-A01的表达，对该基因在棉花抗黄萎病中的功能进行初步分析，为丰富棉花抗病基因资源提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试植物材料及生长条件。供试棉花材料为陆地棉标准品系TM-1。首先将TM-1的带绒种子用98%的硫酸溶液浸泡，然后在清水中多次洗涤后晾干；用70%的乙醇溶液进行表面消毒后用无菌水冲洗。每盆（直径为7 cm，高8 cm）播种5粒，共18盆。播种后将材料移至温室（28 ℃、16 h光照/8 h黑暗）生长。
烟草材料为本氏烟（Nicotiana benthamiana），由新疆农作物生物技术重点实验室繁殖保存，并种植于新疆农业科学院棉花楼光照培养室（28 ℃、16 h光照/8 h黑暗）。烟草每盆播种4粒，出苗后每盆留2株。
1.1.2 黄萎病菌。黄萎病菌强致病力的V991菌株由本实验室保存。用无菌去离子水将V991菌液稀释至孢子含量为1×106～1×107mL－1，作为接种棉花的孢子悬浮液。
1.1.3 供试载体和菌株。亚细胞定位载体pCAMBIA1302、烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus， TRV）载体、阳性对照载体TRV-GhCLA1、大肠杆菌TOP10和农杆菌菌株GV3101均由本课题组保存。
1.2 方法
1.2.1 GhCBL3-A01基因的克隆和序列分析。从棉花基因组数据库网站（https：//www.cottongen.org）[26]获得GhCBL3-A01基因的全长序列。在TM-1叶片中扩增GhCBL3-A01的全长序列。通过序列比对得到GhCBL3-A01的3个同源基因（Gh_D01G0760， Gh_A04G0051和 Gh_A13G1099）的序列。使用DNAMAN软件对这4个同源基因的蛋白序列进行比对分析。利用在线网站GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分别绘制4个同源基因的基因结构和蛋白保守结构域。从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）数据库（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）获得拟南芥AtCBL3、玉米ZmCBL3、小麦（Triticum aestivum）TaCBL3、水稻OsCBL3、油菜（Brassica napus）BnCBL3和烟草（Nicotiana tabacum）NtCBL3的蛋白序列，利用MEGA 5软件进行系统进化分析，设自展值（bootstrap value）为1 000，其他参数为系统默认值。
1.2.2 亚细胞定位。扩增GhCBL3-A01编码序列，构建pCAMBIA1302-35S：：GhCBL3-GFP融合表达载体，将该载体和空载体（pCAMBIA1302-35S-GFP）分别转化农杆菌菌株GV3101。按照Tamara等[27]的方法，将农杆菌菌液接种至3周龄烟草叶片。避光处理2～5 d后在激光共聚焦显微镜下检测绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）信号并拍照。
1.2.3 植物激素与胁迫处理。用灌根法将V991悬浮液（每盆30 mL）施入4周龄棉株的培养盆中，采集处理后0 h、0.5 h、2 h、6 h、12 h和24 h的根系样品。分别用200 μmol·L－1MeJA和1 mmol·L－1 H2O2喷施叶片，每盆用量均为50 mL，于处理后0 h、0.5 h、1 h 、2 h 和 3 h采集根系样品[6]。上述所有处理均以3份样本混合作为1个重复，每个处理重复3次，以等量清水处理作为对照（Mock）。将样品迅速放在液氮中，于－80 ℃保存用于后续提取RNA。
1.2.4 基因表达分析。采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441，天根生化科技有限公司）提取RNA。用反转录试剂盒EasyScript? One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）制备cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，根据ABM荧光定量试剂盒说明书，以陆地棉泛素基因GhUBQ7（DQ116441）为内参基因，使用Applied Biosystems StepOne荧光定量仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR），用2－ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。所用引物信息见附表1。
1.2.5 VIGS实验。利用primer 5.0软件在GhCBL3-A01基因的第303个碱基至终止子区设计扩增长度为378 bp的特异引物。将此特异片段连接至VIGS载体中。分别将TRV：：GhCBL3-A01载体和阳性对照载体TRV：：GhCLA1与TRV：：RNA1载体转化至农杆菌GV3101，并于－80 ℃储存。待棉花幼苗生长至子叶完全展开时，参照邵武奎等[13]的方法分别将农杆菌菌液注射至棉花幼苗子叶中，23 ℃黑暗处理24 h后正常培养。重复3次以上，每次重复至少注射120个植株。
1.2.6 棉花植株抗病性分析。VIGS处理大约14 d后，当TRV：：GhCLA1阳性对照棉株出现白化表型时，用qRT-PCR检测TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01叶片中GhCBL3-A01的相对表达量。选取长势一致的大约90株棉花幼苗用灌根法接种V991孢子悬浮液。接种后16 d和20 d，调查植株的发病情况，并计算病株率和病情指数（disease index， DI）。病株率＝发病株数/总株数×100%。病情指数＝∑（各级病株数×相应病级值）/（调查总株数×最高病级值）×100。相应的病级分级标准如下：0级为植株无症状表现；1级为1～2片真叶发病；2级为3～4片真叶发病；3级为4片以上真叶发病或脱落；4级为全株枯死[28]。
取子叶节下方1 cm处茎段置于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar， PDA）培养基培养5 d后，观察茎段上黄萎病菌的生长情况并统计被感染的茎段数量。对照植株和沉默植株分别采集30个茎段。对采集的茎段进行剖秆，观察维管束褐变情况并拍照。
提取对照植株和沉默植株的茎段DNA，利用真菌特异性 ITS1-F引物与V. dahliae特异性引物 ST-VE1-R进行qRT-PCR，检测黄萎病菌V991 DNA的相对丰度，以GhUBQ7作为内参（引物序列见附表1）。
1.2.7 ROS测定和相关基因的表达分析。接种V991后24 h，取TRV：：00 和 TRV：：GhCBL3-A01植株的第2片真叶，每个材料至少选择3株。参考Li等[29]的方法分别用3，3- 盐酸二氨基联苯胺（3，3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride， DAB-HCl）和台盼蓝进行染色。在显微镜下观察叶片颜色的变化情况。
取接种V991后24 h的棉花叶片，通过qRT-PCR分析目的基因的相对表达量。NPR1（Gh_A08G2190）、PDF1.2（Gh_D01G2290）、 PR1 （Gh_A12G0274）和PR4 （Gh_D13G1816）这4个抗病相关基因和JA信号通路相关基因AOS1（Gh_D05G2484）、OPR3（Gh_D05G0339）、MYC2（Gh_A08G1412）和LOX2（Gh_A05G0552）的引物序列见附表1，以GhUBQ7为内参基因，方法同1.2.4，重复3次。
1.3 数据处理与分析
用Microsoft Excel 2019软件对数据进行整理。用SPSS 19.0软件进行统计分析，用邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 GhCBL3-A01的生物信息学分析和表达模式分析
与未接菌的对照相比，GhCBL3-A01基因在接种黄萎病菌后2 h、6 h、12 h和24 h表达量显著升高，推测GhCBL3-A01可能参与调控棉花黄萎病抗性（图1A）。序列分析表明，GhCBL3-A01基因编码区全长681 bp，编码含有226个氨基酸残基的多肽。经预测，GhCBL3-A01蛋白质分子质量为25.9 ku，等电点为4.77。GhCBL3-A01及其在陆地棉中的3个同源基因均含有8个外显子、7个内含子（附图1）。这4个同源基因编码的蛋白均含有3个典型的EF-hand（EFh）结构域（附图2）。蛋白序列比对分析发现GhCBL3-A01与GhD01G0760编码蛋白的序列一致性为99.71%，GhCBL3-A01与拟南芥AtCBL3序列相似性也较高（附图3）。对蛋白序列进行系统进化分析表明，与GhCBL3-A01序列最接近的蛋白是GhD01G0760编码蛋白、BnCBL3和AtCBL3，而GhCBL3-A01的其他2个同源基因（GhA04G0051和GhA13G1099）编码的蛋白分别与AtCBL4、AtCBL8和AtCBL5的关系更为密切（图1B）。
利用qRT-PCR分析GhCBL3-A01在MeJA和H2O2处理后棉花幼苗根系中的转录水平。结果表明，GhCBL3-A01的表达量受MeJA和H2O2的影响。MeJA处理后1 h和2 h，GhCBL3-A01的表达量显著高于对照处理（图1C）。H2O2处理后0.5 h，GhCBL3-A01的表达量显著低于对照处理；H2O2处理后2 h，GhCBL3-A01的表达量显著高于对照处理（图1D）。以上结果表明GhCBL3-A01受V991、MeJA和H2O2诱导表达，可能通过JA信号通路参与对棉花黄萎病的防御反应。
2.2 GhCBL3-A01亚细胞定位分析
在烟草叶片中瞬时表达GhCBL3-A01，GhCBL3-A01-GFP融合蛋白的荧光分布在烟草叶片表皮细胞质膜，对照处理的荧光分布在细胞质膜（图2），表明GhCBL3-A01蛋白定位于细胞质膜上。
2.3 沉默GhCBL3-A01增强棉花对黄萎病的抗性
为进一步探究GhCBL3-A01在棉花黄萎病抗性中的功能，采用VIGS技术降低GhCBL3-A01的表达。侵染后14 d，阳性对照TRV：：GhCLA1棉株新展开的真叶出现白化表型，表明VIGS系统在本实验条件下是有效的（图3A）。通过qRT-PCR检测GhCBL3-A01在TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01植株叶片中的转录水平，发现TRV：：GhCBL3-A01植株中GhCBL3-A01的表达量极显著降低（图3B）。
棉花三叶期接种黄萎病菌V991。接种病原菌后16 d，TRV：：00植株叶片萎蔫和黄化的程度比TRV：：GhCBL3-A01植株更严重（图3C）。接种V991后16 d，TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01的病株率分别为50.55%和36.54%，病情指数分别为34.55和22.74，均存在显著差异；接种V991后21 d，TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01的病株率分别为72.05%和47.45%，病情指数分别为67.79和39.77，差异均极显著（图 3D～E）。TRV：：00植株茎秆维管束褐化程度比TRV：：GhCBL3-A01植株更明显（图3F）。茎段培养发现，TRV：：GhCBL3-A01有病菌繁殖的茎段数明显低于TRV：：00植株（图3G）。黄萎病菌丰度检测显示，在TRV：：GhCBL3-A01植株中检测到的黄萎病真菌DNA水平极显著低于TRV：：00植株（图3H）。以上结果表明，沉默GhCBL3-A01增强了棉花对黄萎病的抗性，GhCBL3-A01是棉花黄萎病抗性的负调控因子。
2.4 GhCBL3-A01基因抗病机制分析
根据以上研究结果，GhCBL3-A01受H2O2诱导表达，且该基因负调控棉花对黄萎病菌的抗性。由此推测，沉默GhCBL3-A01可能影响ROS积累和细胞的氧化状态，进而增强棉株的黄萎病抗性。为证实这一推测，用DAB 进行染色，检测黄萎病菌侵染后TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01幼苗叶片的ROS积累情况，发现TRV：：GhCBL3-A01的叶片中褐色斑点更多（图4A）。台盼蓝染色发现相较TRV：：GhCBL3-A01，TRV：：00的叶片出现更多的蓝色斑点聚集（图4B）。表明GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中ROS积累增多，细胞死亡减少。这进一步证实沉默GhCBL3-A01会影响黄萎病菌侵染后棉花叶片中ROS积累，进而有助于提高棉花的抗病性。
与清水处理相比，接种V991后TRV：：00及TRV：：GhCBL3-A01植株中NPR1、PDF1.2、PR1和PR4这4个防御相关基因的表达量均增加。接种V991后，与对照TRV：：00相比，NPR1、PDF1.2、PR1和PR4 这4个防御相关基因在TRV：： GhCBL3-A01棉株中的表达水平显著升高。而清水处理下，TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01植株中PDF1.2、PR1和PR4的表达量无显著差异，TRV：：GhCBL3-A01植株中NPR1的表达量显著高于TRV：：00（图 4C～F）。与清水处理相比，接种V991后TRV：：00与TRV：：GhCBL3-A01植株中JA信号通路相关基因AOS1、OPR3 和MYC2的表达量增加，而LOX2的表达量降低。在清水处理及接种V991后，TRV：：GhCBL3-A01植株中AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量均显著高于TRV：：00植株（图 4G～J）。上述结果表明在黄萎病菌处理下，沉默GhCBL3-A01导致防御相关基因和JA信号通路相关基因的表达上调，从而增强了棉花植株的抗病性。
3 讨论
Ca2＋作为1种重要的次级信使，广泛参与非生物和生物应激反应中的细胞信号传导。Ca2＋传感器蛋白CBL参与不同的生物学过程[21]。本研究发现GhCBL3-A01参与调节棉花对黄萎病菌的抗性。黄萎病菌V991侵染后，GhCBL3-A01的表达水平先升高后降低，表明GhCBL3-A01是黄萎病菌的应答基因。JA和H2O2处理均可诱导GhCBL3-A01的表达。已有研究表明JA在植物对病原菌侵染的先天性免疫应答中起着重要作用[30]，JA信号的改变可影响植株对黄萎病菌的抗性[31]。钙依赖蛋白激酶GhCPK33可以磷酸化GhOPR3导致后者的稳定性降低，从而抑制JA的生物合成，负调控黄萎病抗性[6]。BIN2与JAZ蛋白相互作用并在植物对黄萎病菌的防御反应中起负调控作用[32]。外源施用JA可诱导拟南芥叶片中胞质游离Ca2＋浓度增加[33]。由于JA通常诱导产生系统获得性抗性，推测GhCBL3-A01可能参与棉花对黄萎病的响应并通过 JA信号途径发挥作用。植物免疫应答涉及ROS信号通路，激活细胞外ROS的产生，引起激酶级联反应与局部细胞死亡，即超敏反应[34]。CDPK可以感知细胞质Ca2＋信号，CDPK5和激酶BIK1不仅正调控flg22引发的Ca2＋内流，而且直接磷酸化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）氧化酶RBOHD以激活ROS的产生[35]。本研究中，与对照相比，GhCBL3-A01基因沉默棉花叶片在黄萎病菌侵染后ROS的积累明显增加，细胞死亡减少。因此，GhCBL3-A01在棉花黄萎病抗性响应中的功能可能与ROS的积累有关。
接种V991后，与TRV：：GhCBL3-A01植株相比，TRV：：00植株的萎蔫和黄化更为严重，维管束褐化明显，且病株率和病情指数显著升高，TRV：：00植株中检测到的黄萎病真菌DNA水平显著高于TRV：：GhCBL3-A01植株，说明GhCBL3-A01负调控棉花黄萎病抗性。研究发现，植物一旦感知到入侵的病原体，就会分泌蛋白质进入外质体，植物免疫系统可识别保守的分子模式进而引发一系列的免疫反应[36]。病原相关蛋白PR1与烟草对卵菌病原菌的抗性有关[37]。几丁质酶PR4是1种内源性植物防御酶，参与产生防御相关的信号分子[38]。本研究发现，TRV：：GhCBL3-A01棉花植株受到黄萎病菌侵染后，抗病相关基因PR1、PR4、NPR1和PDF1.2的表达水平明显上升。MeJA处理后，GhCBL3-A01的表达量明显上调。接种V991后，TRV：：GhCBL3-A01植株中JA信号通路相关基因AOS1、OPR3和MYC2的表达量增加，而LOX2的表达量降低，但均显著高于对照TRV：：00植株，表明沉默GhCBL3-A01可能会影响JA信号通路相关基因的表达及JA信号通路，但GhCBL3-A01参与JA信号通路的具体机制仍有待进一步研究。
4 结论
黄萎病菌、MeJA及H2O2处理均可诱导GhCBL3-A01表达。利用VIGS技术抑制GhCBL3-A01的表达可提高棉花对黄萎病的抗性，导致叶片ROS积累量增加，接种V991后防御相关基因和JA信号通路相关基因的表达水平显著高于对照植株。说明GhCBL3-A01通过调节ROS积累、防御相关基因和JA信号通路相关基因的表达负调控棉花黄萎病抗性。
附图附表：
详见本刊网站（http：//journal.cricaas.com.cn/）本文网页版。
附表1 本研究所用的引物序列
Table S1 Primer sequences used in this study
附图1 GhCBL3-A01及其同源基因的结构
Fig. S1 Structures of GhCBL3-A01 and its homologous genes
附图2 GhCBL3-A01及其同源蛋白的保守结构域
Fig. S1 Conserved domains of GhCBL3-A01 and its homologous proteins
附图3 GhCBL3-A01同源蛋白的多序列比对
Fig. S3 Multiple sequence alignment of GhCBL3-A01 homologous proteins
参考文献：
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（责任编辑：王小璐 责任校对：秦凡）
收稿日期：2023-11-23 第一作者简介：高升旗（1984―），男，助理研究员，gaoshengqi@xaas.ac.cn。 *通信作者：hquansheng@126.com
基金项目：国家自然科学基金——新疆联合基金（U1703114）；中央引导地方科技发展专项资金项目（ZYYD2022B07）
