妊娠期糖尿病患者外周血NOX5基因甲基化检测

吴越 杨宗军 徐瑛蕾 张璐 潘月帅 魏丽丽

［摘要］ 目的 檢测妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）患者外周血NOX5基因甲基化状态，并分析其与GDM的相关性。方法 以2020—2021年我院产科门诊确诊为GDM的孕妇67例为病例组，同期门诊口服糖耐量正常的健康孕妇87例为对照组，采用甲基化特异性PCR方法检测两组孕妇NOX5基因甲基化状态，并根据NOX5基因甲基化状态将病例组孕妇分为阳性亚组44例和阴性亚组23例，根据是否胎儿窘迫、是否巨大儿将154例新生儿分为窘迫组（6例）和非窘迫组（148例）、巨大儿组（11例）和非巨大儿组（143例），分析NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇一般资料及妊娠结局的相关性。结果 病例组和对照组NOX5基因甲基化阳性构成比分别为65.67%、40.23%，两组比较差异有显著性（χ2=9.807，P＜0.05），阳性亚组和阴性亚组比较孕妇年龄、孕前体质量指数（BMI）、收缩压、舒张压、空腹血糖差异无显著性（P>0.05）。胎儿窘迫组与非窘迫组、巨大儿组与非巨大儿组NOX5基因甲基化阳性构成比比较差异无显著性（P>0.05）。结论 GDM患者NOX5基因易发生甲基化，但NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇年龄、孕前BMI、血压、空腹血糖无明显相关，与胎儿窘迫、巨大儿也无明显相关。

［关键词］ 糖尿病，妊娠；DNA甲基化；NADPH氧化酶5；胎儿窘迫；巨大胎儿

［中图分类号］ R714.7    ［文献标志码］ A

［ABSTRACT］ Objective To investigate the methylation status of the NOX5 gene in peripheral blood of patients with gestational diabetes mellitus （GDM） and its association with GDM.  Methods A total of 67 pregnant women who were diagnosed with GDM at the outpatient service of Department of Obstetrics in our hospital from 2020 to 2021 were enrolled as case group， and 87 healthy pregnant women with normal oral glucose tolerance test results during the same period of time were enrolled as control group. Methylation-specific PCR was used to determine the methylation status of the NOX5 gene， and according to the methylation status of the NOX5 gene， the pregnant women in the case group were further divided into positive subgroup with 44 women and negative subgroup with 23 women. According to the presence or absence of fetal distress or fetal macrosomia， 154 neonates were divided into distress group with 6 neonates and non-distress group with 148 neonates， as well as fetal macrosomia group with 11 neonates and non-fetal macrosomia group with 143 neonates. The methylation status of the NOX5 gene was analyzed in terms of its association with the general information and pregnancy outcome of the pregnant women with GDM.  Results There was a significant difference in the constituent ratio of positive NOX5 gene methylation between the case group and the control group （65.67% vs 40.23%，χ2=9.807，P<0.05）， and there were no significant differences between the positive subgroup and the negative subgroup in age， pre-pregnancy body mass index （BMI）， systolic blood pressure， diastolic blood pressure， and fasting blood glucose （P>0.05）. There was no significant difference in the constituent ratio of positive NOX5 gene methylation between the distress group and the non-distress group and between the fetal macrosomia group and the non-fetal macrosomia group （P>0.05）.  Conclusion NOX5 gene methylation is often observed in pregnant women with GDM， but the methylation status of the NOX5 gene is not associated with the age， pre-pregnancy BMI， blood pressure， and fasting blood glucose of pregnant women with GDM， and it is also not associated with fetal distress and fetal macrosomia.

［KEY WORDS］ Diabetes， gestational; DNA methylation; NADPH oxidase 5; Fetal distress; Fetal macrosomia

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指孕婦妊娠期首次发生和发现的不同程度的糖代谢异常[1]，不仅会增加巨大儿、先天畸形的发生率，还会增加孕妇患子痫等疾病的风险，对母婴及后代的健康影响极大[2]。GDM与2型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）的病理特征均为胰岛β细胞凋亡、胰岛素抵抗，并且GDM孕妇后期发生T2DM的风险亦显著增加，因此GDM也被认为是T2DM的早期阶段，两者可能存在着相似的遗传基础[3]。DNA甲基化是表观遗传的重要方式，在各种疾病的发生发展中起着关键作用[4]。近年来的研究表明DNA甲基化与T2DM等代谢疾病密切相关，其主要作用是抑制调控胰岛素分泌基因的表达，造成胰岛素分泌减少，最终形成T2DM。既往研究显示，T2DM患者外周血中存在基因的甲基化[5]，而T2DM与GDM存在相似的遗传基础，因此GDM患者外周血中也可能存在控制胰岛素分泌基因的甲基化。NADPH氧化酶（NOX）5是NOX家族的7个成员之一，目前研究已经了解到NOX5的同源物NOX2、NOX4可以导致胰岛β细胞凋亡及胰岛素抵抗[6-7]，但由于NOX5发现的时间较短，且不存在于大鼠和小鼠中，所以目前尚没有关于NOX5基因与糖尿病相关性的研究。本研究通过甲基化特异性PCR方法，分析NOX5基因甲基化状态与GDM的相关性。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2020—2021年我院产科门诊就诊最终诊断为GDM的67例患者为病例组，患者平均年龄为（33.76±4.56）岁，孕前体质量指数（BMI）（21.89±2.28）kg/m2，收缩压（16.01±2.11）kPa，舒张压（10.06±0.97）kPa，胎儿窘迫6例，巨大儿11例。另选取同期在同一产科门诊就诊口服糖耐量正常的健康孕妇87例为对照组，孕妇平均年龄（33.86±3.70）岁，孕前BMI（21.19±2.11）kg/m2，收缩压（15.71±1.43）kPa，舒张压（10.02±1.01）kPa，无胎儿窘迫和巨大儿情况。GDM的诊断标准采用美国糖尿病协会2019年标准[8]；胎儿窘迫、巨大儿的诊断参照《妇产科学》第7版中的标准。两组孕妇年龄、孕前BMI、收缩压、舒张压比较差异均无显著性（P>0.05），而胎儿窘迫、巨大儿情况比较差异有显著性（P＜0.05）。两组均排除存在输血史、免疫治疗史及其他并发症的孕妇。

1.2 样品采集与处理

采集每一位孕妇的静脉血5 mL于抗凝管中，—80 ℃冰箱冻存。使用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。使用基因甲基化检测试剂盒（ZYMO生物科技公司，美国）进行亚硫酸盐转化。使用甲基化特异性PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司）对制备好的DNA进行扩增，采用Meth Premier 5.0软件设计引物，引物名称及序列详见表1。反应条件：95 ℃预变性5 min；然后4 ℃变性20 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，总共进行35个循环；最后以72 ℃中止5 min。PCR总反应体系为20 μL，内含DNA 500 ng，上下游引物各1 μL，dNTPs 1.6 μL，Taq酶0.4 μL，Buffer溶液2 μL，加蒸馏水补足至20 μL。取PCR产物10 μL置于15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外线检测仪检测。基因甲基化判断标准：①甲基化：仅存在甲基化条带，或甲基化、非甲基化条带同时存在的样品；②非甲基化：仅存在非甲基化条带的样品。

1.3 NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇一般资料及妊娠结局的相关性

根据NOX5基因甲基化状态将病例组孕妇分为阳性亚组（44例）和阴性亚组（23例）。另外根据是否胎儿窘迫将154例新生儿分为窘迫组（6例）和非窘迫组（148例），根据是否巨大儿将154例新生儿分为巨大儿组（11例）和非巨大儿组（143例），分析NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇一般资料及妊娠结局的相关性。

1.4 统计学处理

使用SPSS 23.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。计数资料以例（率）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结  果

2.1 两组孕妇NOX5基因甲基化状态比较

病例组与对照组孕妇NOX5基因甲基化阳性构成比分别为65.67%、40.23%，差异具有显著意义（χ2=9.807，P＜0.05）。

2.2 NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇一般资料的关系

阳性亚组与阴性亚组相比较，孕妇年龄、孕前BMI、收缩压、舒张压、空腹血糖差异无显著性（P>0.05）。见表2。

2.3 NOX5基因甲基化状态与妊娠结局的关系

窘迫组、非窘迫组NOX5基因甲基化阳性构成比分别为83.33%、50.00%，两组比较差异无显著性（P>0.05）；巨大儿组、非巨大儿组NOX5基因甲基化阳性构成比分别为72.73%、49.65%，两组比较差异无显著性（P>0.05）。

3 讨  论

GDM是孕期常见的并发症[9]，随着孕妇肥胖人群比例的增加，GDM的发病率也逐年增高[10]。流行病学调查发现，GDM存在显著的种族差异，遗传因素在GDM孕妇的发病中发挥着非常重要的作用[11-12]。GDM与T2DM具有相似的代谢特征和遗传背景，被认为是T2DM的早期阶段，所以通常借鉴T2DM的遗传学研究方法来探讨GDM发生的病因及机制[13]。DNA甲基化是表观遗传的重要方式，在遗传调控中起着重要作用[14]，可以解释糖尿病等多种慢性疾病的发生机制。当调控胰岛素分泌的基因发生异常甲基化时，会抑制胰岛素信号通路的传导，造成胰岛素分泌减少，这可能是T2DM形成的一个重要因素[15]。由于T2DM与GDM有着相似遗传背景，所以DNA甲基化也可能是GDM发生的重要原因。

NOX家族是活性氧（ROS）的主要來源，是细胞内生成ROS的主要物质，在正常情况下ROS可以调节胰岛素分泌，维持正常的生理过程，但是当ROS在体内大量积聚时，会对糖酵解和三羧酸循环进行抑制，抑制胰岛β细胞的功能，使胰岛素分泌减少，最终参与糖尿病的发生[16-19]。NOX5基因是NOX家族的一员，位于15号染色体q22.31处，可以生成ROS。目前还没有关于NOX5与GDM的相关性研究，但是NOX5基因可以促进糖尿病并发症的发生和发展，动物实验表明NOX5基因的过表达可以使ROS生成增加，加速肾小球硬化，促进糖尿病肾病的发展[20]。同时，NOX5基因甲基化对子痫前期的发生也有明显的促进作用[21]。糖尿病肾病、子痫都是GDM孕妇产后常见的并发症，并且两者在GDM孕妇当中的发病风险均明显高于正常孕妇[22-23]，由此可以推断NOX5基因可能与GDM孕妇的发病有关。

本研究采用甲基化特异性PCR方法检测GDM孕妇外周血NOX5基因甲基化状态，结果显示，病例组孕妇NOX5基因甲基化阳性构成比显著高于对照组，同时NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇年龄、孕前BMI、收缩压、舒张压、空腹血糖无明显相关，与胎儿窘迫、巨大儿也无明显相关。本研究结果说明NOX5基因甲基化可能参与了GDM的发生，但是与GDM孕妇的一般资料及妊娠结局无相关，原因可能是GDM是一种发病机制十分复杂的疾病[24-25]，NOX家族促进胰岛β细胞凋亡及胰岛素抵抗只是其中一方面原因，NOX5基因甲基化如何参与血糖的代谢有待下一步研究；此外本研究属于单中心研究，后期可纳入多中心样本，以便深入探究NOX5基因甲基化与GDM孕妇一般资料及妊娠结局的关系。

总之，本研究结果表明GDM孕妇的NOX5基因易发生甲基化，但是NOX5基因甲基化状态与GDM孕妇年龄、孕前BMI、血压、空腹血糖无明显相关关系，与胎儿窘迫、巨大儿也无明显相关关系。NOX5基因与GDM的相关性仍需后续实验进一步研究验证。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准（文件号QYFYWZLL27449）。所有试验过程均遵照《人体医学研究的伦理准则》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

作者声明：吴越、杨宗军、魏丽丽参与了研究设计；吴越、徐瑛蕾、张璐、潘月帅参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。

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（本文編辑 耿波 厉建强）