DNA甲基化对植物生长发育的调控研究

孟彩凤　周颖

摘 要：DNA甲基化修饰在表观遗传中占据重要的位置，DNA甲基化会改变启动子调节区域的功能状态，但不会改变胞嘧啶碱基序列。在植物中DNA甲基化发生在C的任何序列上：CG，CHG及CHH（H=A，T或者C）。植物中的DNA甲基转移酶主要分为3类，染色质甲基化酶（CMT）、甲基转移酶I（MET I）和结构域重排甲基转移酶（DRM）。DNA甲基化主要通过调控基因的表达，如植物转座子的沉默，内源基因表达，春化作用，植物防御作用等，进而调节植物的生长发育。

关键词：DNA甲基化；植物；生长发育

中图分类号 Q7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）10-29-04

Abstract：DNA methylation plays a dominant role in epigenetic mark.DNA methylation can change the function of regulatory regions without changing the cytosine base paring.In plants，any sequence of cytosine could be mathylated，including the symmetric CG，CHG，and the asymmetric CHH（H=A，T or G）.And there are three kinds of DNA methyltransferases in plants：Chromomethlase（CMT），DNA METHYLTRANSFERASE 1（MET1），DOMAINSREARRANGED METHYLTRANSFERASE（DRM）.DNA methylation regulates the growth and development of plants through regulating gene expression，transposon silencing，endogenous gene expression，vernalization，plant defense and so on.

Key words：DNA methylation；Plant；The growth and development

1 表观遗传学与表观基因组

公元前3世纪，古希腊哲学家Aristoteles在《论动物生成》中提出了相对于先成论（pre-formation）的后成理论（epigenesis），他认为新器官是由未分化的团块发育形成的。1939年，发育生物学家Conrad Waddington根据希腊词epigenesis正式提出表观遗传学的定义，他指出表观遗传主要是研究基因型（genotype）产生表型（phenotype）的过程，1942年他提出基因与表型之间存在一种因果机制，将这种控制机制定义为表观遗传学，并将表观遗传学列为生物学的一个分支。1975年，生物学家Robin Holliday比较系统的概括了表观遗传学的定义，即表观遗传学是研究在DNA序列不发生改变的情况下，引起基因表型改变，并且通过有丝分裂、减数分裂等遗传方式能够在细胞与个体间传递，这种传递不遵循孟德尔遗传规律的。经过近80a的演变，逐渐形成了我们今天对表观遗传的定义：在DNA序列不发生改变的情况下，全基因组范围内使表型能够稳定遗传的修饰机制[1]。表观遗传修饰包括DNA甲基化修饰，ATP依赖的染色质重塑，组蛋白共价修饰，组蛋白变体和非编码RNA编辑。众所周知，在许多真核生物中，基因组的活动是由组蛋白修饰和DNA甲基化来调控的，虽然我们不能忽视染色质的其他修饰（包括H3K27me3）也属于表观遗传的事实[2-3]，但是DNA的甲基化在表观遗传中占据了主要的位置，而且DNA甲基化是表观遗传标记中最早发现且研究比较透彻的。

DNA甲基化为全基因组DNA提供了一种可逆的分子标记方法。细菌可以将自身基因组中的腺苷酸或者胞嘧啶甲基化，以识别并降解入侵的外来DNA，同时还可以在细胞分裂前追踪错配修复和基因组复制的进度[4-5]。在植物和哺乳动物中，DNA甲基化修饰作为可遗传的表观遗传修饰调控基因的表达[6-8]。真核生物DNA的甲基化只发生在胞嘧啶上，而且DNA序列CG中胞嘧啶的甲基化和组蛋白的H3中第9位的赖氨酸（H3K9me3）的三甲基化通常是在细胞分裂时通过DNA半保留复制的方式而获得的[9-11]。自从这一现象被发现，把在体外甲基化的DNA导入抓蟾卵母细胞[12]或者培养的哺乳动物细胞中[12-13]此DNA的转录就会暂停，DNA甲基化就在功能上与抑制基因表达联系起来了。重要的是，很多生物体中都不存在甲基化，所以甲基化不总是真核生物调控基因表达所必不可少的，这些生物体包括多细胞动物，如双翅目昆虫、秀丽隐杆线虫，这说明在发育过程中的转录调节，生物体不一定要DNA甲基化。而在很多进化枝中，DNA甲基化都是必不可少的，其普遍性及其在基因组上分布的广泛性，表明由于DNA甲基化作用不同其存在模式也不同[14-16]。

2 DNA甲基化对基因表达的抑制机理

DNA甲基化能够引起DNA的构象、DNA的稳定性、染色质的结构以及DNA与蛋白质之间的相互作用方式的改变，因此其在生物体的生长发育调节、基因表达调控以及基因组印迹等许多方面都有着不可替代的重要作用。

2.1 DNA甲基化直接干扰转录因子与启动子识别序列的结合 DNA分子双螺旋结构是其特有的特殊结构，而转录因子与DNA结合的部位就在DNA双螺旋的大沟中，能够被许多蛋白质转录因子所识别并结合的启动子序列也都会突出于大沟内，这些可被转录因子识别的序列中含有CpG位点[17]，当CpG位点的胞嘧啶被甲基化之后，诸如AP-2（碱性磷酸酶）、E2F（转录因子）、NF-κB（反式作用因子）、CAREB（周期性AMP依赖的启动因子）等在内的许多对DNA甲基化位点敏感的转录因子就会不再和相应的启动子序列结合，这就导致了相应基因的转录无法启动，进而导致相应基因不能表达。但是还有一些例如SP1、CTF等等在内的转录因子对CpG二核苷酸胞嘧啶的甲基化并不敏感，因此这些转录因子所调节的基因的表达也就不会受到甲基化的影响[18]。

2.2 特异的转录抑制物——甲基CpG结合蛋白与CpG的结合 当转录因子中的启动子识别序列中含有被甲基化的CpG序列时，特异的转录抑制物即甲基CpG结合蛋白（methyl-CpG bingding protein，MBP）就会与相应的转录因子竞争该甲基化序列上的相应结合位点，进而也就导致了相应基因的转录与表达被抑制。

2.3 DNA甲基化通过改变染色质的结构起到抑制基因转录表达的作用 除了上述2种方式之外，DNA甲基化还能够通过诱导染色质失去活性、阻止相应的转录因子进入等方式来起到阻止染色质的活化的作用[19]。目前对于通过DNA甲基化来抑制基因的转录表达活性的研究主要是围绕着基因沉默、DNA的高度甲基化以及结构多变的染色质之间的联系进行的。在哺乳动物中，DNA甲基化、基因沉默、染色质结构之间存在着某种内在的联系，这种现象在很多年前就已经被人们所发现。早期的研究显示，高度甲基化的CpG二核苷酸序列与细胞核内的异染色质的形成有关，而体外的实验结果表明，DNA甲基化与染色质质凝聚形成染色体有关，其它的研究结果也表明未被甲基化或者低水平甲基化的CpG岛大多集中在高度乙酰化的组蛋白上。出现这种机制的原因一直以来都不清楚，最近有研究发现染色质的结构能都调节基因的表达，这个理论有可能能够证实这种机制。

染色质的构象呈现动态变化，那么其DNA的高度甲基化是否会伴随着组蛋白的乙酰化和去乙酰化？这2个转录沉默通路间的相互作用机制是怎样的？在导致转录沉默的众多机制中，DNA甲基化是否占据主要地位？这许多的疑问还尚未被解开，还需要进一步的研究，这也从侧面说明了DNA甲基化领域的复杂性与奇妙性。

3 植物DNA甲基转移酶

根据DNA甲基转移酶催化反应的类型，可以将其分为3类：第1种类型的DNA甲基转移酶可以将腺嘌呤转变为N6-甲基腺嘌呤；第2种类型则能将胞嘧啶转变为N4-甲基胞嘧啶；第3种DNA甲基转移酶催化的是最常见的DNA甲基化类型，就是将胞嘧啶转变成为C5-甲基胞嘧啶。在原核生物中，这3种类型的DNA甲基转移酶均可见到，它们主要参与了原核生物的限制-修饰系统、调节其DNA的复制和抗噬菌体感染的“免疫应答”。而在高等真核生物中，则只发现有第3种类型的DNA甲基转移酶的存在，即DNA C5胞嘧啶甲基转移酶。DNA C5胞嘧啶甲基转移酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基的供体，将甲基基团转移到胞嘧啶的第5位碳原子上以完成DNA甲基化的全过程。根据其功能，DNA C5胞嘧啶甲基转移酶又可分成以下2类：一类是维持DNA甲基化的甲基转移酶，这种类型的DNA甲基转移酶主要是在DNA进行半保留复制的时候，根据亲本链上特异的被甲基化修饰的位点，在新生成的新生链的相应位置上也进行同样的甲基化修饰，这样就使得在生物一代代遗传的过程中，母体DNA甲基化的信息不会丢失，保证了生物体的稳定性；另一类是DNA重头甲基化转移酶，这种类型的酶主要是在生物体发育过程中使去甲基化的CpG位点重新再甲基化。

截至目前，在植物中发现的DNA甲基转移酶主要有3种，分别是：染色质甲基化酶（CMT）、甲基转移酶I（MET I）和结构域重排甲基转移酶（DRM），这3种DNA甲基转移酶在胞嘧啶不同的DNA序列中的活性是不同的。

3.1 染色质甲基化酶（Chromomethylase，CMT） CMT甲基转移酶在植物中分布十分广泛，它主要是对异染色质DNA进行甲基化修饰。主要作用机理是一个染色质功能域插入在甲基转移酶保守的Ⅱ和Ⅳ亚基之间，这个功能域可以指导一些在DNA甲基化过程中也发挥作用的蛋白到异染色质区域，然后由CMT甲基转移酶催化对异染色质DNA进行甲基化修饰。在拟南芥中，已经发现至少有3个基因编码CMT蛋白，在玉米和十字花科中也发现了2个基因[20-21]。研究发现，CMT3功能的缺失并不能使植物的正常生长发育和生理产生异常，这与另外2种DNA甲基转移酶的突变体不同。

3.2 甲基转移酶I（Methyltransferase I，METI） Finnegan等利用催化结构的高度保守性，从拟南芥中分离得到了第一个植物DNA甲基转移酶MetI的基因，MetI在结构上与哺乳动物的DNA甲基转移酶Dnmt 1十分类似。MetI家族是植物中最重要的一种DNA甲基化酶，在植物DNA甲基转移酶中占有统治地位。它主要的作用是维持重复的和单拷贝的DNA序列的甲基化修饰[22]，从而将亲代DNA序列相应位点甲基化通过DNA复制传递给子代，以保证生物的稳定性，除此之外MetI也很可能在重头甲基化中起作用。MetI起作用的目的DNA大多是CG序列，除了拟南芥外，在豌豆、番茄、胡萝卜和玉米中也已经找到MetI的同源物。

3.3 重新甲基转移酶（domain rearanged methylase，DRM） DRM的结构与Dnmt3十分类似，特异性指导在CNG和CHH（H为除G以外的任何碱基）非对称位点处的DNA序列发生甲基化修饰。DRM家族包括有DRM1、DRM2和DRM3这3个成员。DRM的N端结构域包括有泛素结合序列，表明了DRM有泛素化潜能。DRM除了可以使非对称位点的DNA序列从头甲基化，还能维持失活转座子以及转基因沉默位点的胞嘧啶的甲基化[23]。DRM与真菌的作用方式非常相似，它的多突变体可以在2个位点恢复。

除了上述3种DNA甲基转移酶，在植物中还存在有第4类的DNA甲基转移酶，也就是拟南芥中的DMT11和玉米种的DMT104，这2种DNA甲基转移酶很可能是Dnmt2家族的同类物。虽然它们在很多物种中呈现高度的保守性，但是它们的功能目前未研究清楚[24]。

4 DNA甲基化在植物生长发育中的作用

在一些原核生物中，DNA的甲基化修饰可使其形成对自身基因组的保护，以抵御外来基因的干扰。而在植物中DNA的甲基化主要对其基因的表达起到调控作用，进而对植物的生长发育进行调节，另外DNA甲基化还与植物转基因的沉默有关。

4.1 DNA甲基化是植物正常发育所必需的 研究证实，在植物中DNA甲基化的不足，会使其出现不正常的发育和表型。5-胞苷（5-zaC）是一种去甲基化剂，可以引起基因组DNA甲基化程度的明显降低，用它处理水稻的种子和甘蓝的幼苗发现，成熟植株的基因组DNA甲基化的程度明显降低，表现出很多生长发育异常性状，如叶片小、植株矮小[25]等，并且这些特征大多都可以通过遗传的方式传递给下一代。另外，Finnegan[22]和Nakano[26]等人把DNA甲基转移酶的反义基因即MET1分别转入野生型烟草和拟南芥中，结果发现这些植株的基因组DNA甲基化水平明显降低，且营养生长和生殖生长均发生异常，这种不正常现象的程度与DNA去甲基化的水平呈现正比关系。这些都说明了DNA甲基化对于植物来说是其维持正常的生长发育所必需的，在植物的生长发育以及其它过程中都起着不可替代的关键调控作用。

4.2 DNA甲基化与植物的春化作用 春化作用是通过DNA甲基化的改变来发挥作用的。用5-胞苷（5-zaC）对植物进行处理可引起早花，说明基因组DNA甲基化程度的降低对开花起到促进作用，而对春化作用不敏感的植物则对5-胞苷的处理没有反应，这些都说明春化作用与DNA甲基化是密切相关的。同时，反义构建植物DNA甲基化水平的降低，使其在没有低温处理时也促进了开花作用，而且对开花作用的促进作用与基因组DNA甲基化水平的降低程度呈正相关。虽然春化对开花的促进作用机理还不清楚，但其与DNA甲基化的密切联系为其机理的研究提供了新的思路。

4.3 DNA甲基化可调节植物内源基因的表达 在不同的发育时期以及不同的生长环境下，植物发育的情况是不同的[27]，以适应生存的需要，这主要取决于植物内源基因的选择性表达，与基因组本身的核苷酸序列无关。植物基因组DNA的甲基化在这个过程中起到了不可替代的调节作用。当基因处于活跃表达的状态时，DNA甲基化的水平一般较低，然而随着植物的生长发育需要关闭该基因的表达时，该基因的启动子或者编码区就会发生重新甲基化的现象，使其表达受到抑制；相反地，当需要那些表达处于关闭状态的基因重新活化时，该基因的启动子区域就会发生去甲基化过程，去甲基化的启动子对DNaseI有着高度的敏感性，这时基因的转录就开始启动[28]。通过这些机制，植物就可以实现不同发育时期以及不同环境条件下基因的时空表达。

4.4 DNA甲基化对植物基因组防御的作用 在植物基因组中，寄生序列广泛存在，即一些病毒的残存序列和转座子元件等，这些寄生系列的表达会对植物本身基因组的结构和正常有序的基因表达造成破坏。DNA甲基化通过保护自身DNA序列不被自己的DNA限制性内切酶破坏来保护自身基因，又通过对外来DNA序列的切割降解来抵御外来基因组的干扰。同时DNA甲基化通过抑制自身转座子和外来DNA的转录，降低了由于非等位基因之间的转座和重组引起的对基因组的破坏，既保护了植物自身，又抵御了外来基因的干扰。

5 结语

DNA甲基化是最常见的复制后及转录后修饰方式之一，它能够在不改变基因组序列的前提下，对生物体基因的表达及其功能可逆的可遗传的改变，DNA甲基化在基因表达调控、基因组印迹、生物体的发育调节等方面都有着重要作用。

DNA甲基化模式在不同时空的变化是生物体正常生长发育所必需的，因此对早期胚胎DNA甲基化模式的研究，对于揭示在生物体早期特异表达的基因以及对其以后生长发育的研究都是很有价值的。在动物中，早期胚胎的整体甲基化程度的变化早已有了很透彻的研究，在其早期胚胎发育过程中DNA甲基化整体水平呈现波动性变化，然而在植物中相关的研究仍非常有限。

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（责编：张宏民）