柠檬酸对食用菌腐败菌的抑制作用及其作用机制

夏飞　张处处　武子宁　曹时玲　邬培鸿

摘要：腸杆菌和寡养单胞菌是在采收后食用菌中数量较高的致腐细菌，可引起双孢蘑菇、杏鲍菇等食用菌的腐烂变质.柠檬酸是食品加工中常用的添加剂，对大肠杆菌、沙门氏菌等食源性病原菌有较强的抑制作用，具有无臭、无毒害、无残留等优势.本研究通过抑菌圈测定、构建时间-抑菌模型揭示柠檬酸对引起食用菌腐败的肠杆菌和寡养单胞菌的抑制效果，并进一步从细胞膜通透性、完整性和菌体形态方面揭示柠檬酸的抑菌机制.结果表明，柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌的抑菌圈直径分别为1.57±0.03 cm、1.93±0.03 cm.根据Logistic方程建立柠檬酸的时间-抑菌模型，预测柠檬酸抑制肠杆菌和寡养单胞菌的最高相对生长下降比分别为36.93±1.58%和80.37±3.96%.经柠檬酸处理，肠杆菌和寡养单胞菌的菌液电导率显著增加（p≤0.001），MIC处理组12 h后分别达到5.47±0.01 ms/cm和5.01±0.01 ms/cm.此外，肠杆菌和寡养单胞菌的胞外核酸泄露量显著增加，胞外蛋白泄漏量6 h时达到最大.通过扫描电镜观察，柠檬酸处理后菌体表面粗糙，出现褶皱、弯曲，并明显发生破损.柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌具有较好的抑制效果；其作用机制是通过改变细胞膜通透性和完整性，使胞内电解质外流，核酸、蛋白质等大分子外泄，从而抑制菌体生长.本研究可为采收后食用菌腐败菌无害化防治奠定基础.

关键词：柠檬酸； 腐败菌； 抑菌模型

中图分类号：TS255.3文献标志码： A

Antibacterial effect and mechanism of citric acid on

spoilage bacteria of edible mushroom

XIA Fei， ZHANG Chu-chu， WU Zi-ning， CAO Shi-ling， WU Pei-hong（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.are spoilage bacteria in higher numbers in postharvest edible mushroom，which can cause decay deterioration of edible mushrooms such as Agaricus bisporus and Pleurotus eryngii.Citric acid is a common additive in food processing，which has a strong inhibitory effect on food-borne pathogens such as Escherichia coli and Salmonella and has the advantages of being odorless，non-toxic，and having no residues.In this study，the antibacterial effect of citric acid on Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.causing edible mushroom spoilage was revealed through the determination of the inhibition zone and the establishment of the time-inhibition model，and the antibacterial mechanism of citric acid was further revealed from the aspects of cell membrane permeability，integrity，and thalli morphology.The results showed that the inhibition zone diameters of citric acid on Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.were 1.57±0.03 cm and 1.93±0.03 cm，respectively.According to the time-inhibition model of citric acid established by the Logistic equation，the maximum relative growth decline ratios of Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.were predicted to be 36.93±1.58% and 80.37±3.96%，respectively.After citric acid treatment，the conductivity of bacterial suspension increased significantly （p≤0.001） and reached 5.47±0.01 ms/cm and 5.01±0.01 ms/cm，respectively，after 12 hours in the MIC treatment group.In addition，the extracellular nucleic acid leakage increased significantly，and the extracellular protein leakage reached the maximum at 6 hours.Through scanning electron microscope observation，the thalli surface of the bacteria treated with citric acid was rough，wrinkled，bent and obviously damaged.Citric acid had a better inhibitory effect on Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.; It inhibits bacterial growth by altering cell membrane permeability and integrity，allowing the efflux of intracellular electrolytes and the efflux of macromolecules such as nucleic acids and proteins.This study may provide a foundation for the harmless control of spoilage bacteria in edible mushroom.

Key words：citric acid; spoilage bacteria; bacteriostasis model

0引言

食用菌组织鲜嫩，具有很高的食用价值和营养价值，深受消费者的喜爱.然而食用菌采后极易受微生物的侵染，特别是致腐细菌，从而出现褐变、软化、产生异味等品质劣变现象，降低其商业价值.食用菌货架期细菌大量生长繁殖，如金针菇的外源细菌数量5天内便达到1.8×10⁸CFU/g［1］.食用菌采后细菌类群包含成百上千个属，其中仅有少数属被认为是优势腐败细菌，如肠杆菌［2，3］、寡养单胞菌［4，5］、假单胞菌［6］、美洲爱文菌（Ewingella americana）［7］、芽孢杆菌［8］等.

肠杆菌属和寡养单胞菌属细菌是食用菌货架期外源细菌中相对丰度较高的两类腐败细菌，可引起金针菇、双孢蘑菇、杏鲍菇、草菇等食用菌的腐败［1，7，9，10］.这两种细菌不仅是食用菌的致腐细菌，也是一些水果、蔬菜的病原菌，如甜瓜［11］、黄豆芽［12］等.其中，肠杆菌是部分食品贮藏期间的主要优势菌，如鲜湿米粉［13］、豆制品［14］、猪肉［15］等，还可引起魔芋软腐病［16］、马铃薯叶片枯萎［17］、桑细菌性枯萎病［18］等.寡养单胞菌属是一类革兰氏阴性好氧菌群，最适生长温度为20 ℃～37 ℃，广泛分布于临床标本、植物根系、土壤、动物食品等，是引起人和水稻等经济作物感染的条件致病菌［19］.鉴于这两类菌的致腐性和致病性，亟待寻找和制定有效控制这两种细菌在食用菌上生长繁殖的策略.

柠檬酸是从柠檬、柑橘等水果中提取的一种弱有机酸，通常可作为酸味剂和抑菌剂在食品中添加使用，具有无臭、无毒害、无残留等优点.柠檬酸对一些常见的食源性病原菌有较强的抑制作用.采用0.5%柠檬酸可显著抑制大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长［20］.使用0.5%柠檬酸溶液搅拌清洗甜樱桃，可有效将沙门氏菌的菌落浓度降低至10 CFU/mL，几乎达到最低检出菌落数［21］.柠檬酸的抑菌效果还具有持续性的优势，柠檬酸对常见水产病原菌嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、荧光假单胞菌的持续抑菌作用可达6天［22］.因此，柠檬酸在食用菌致腐菌防治方面具有很大的潜力.

目前，生产中食用菌鲜品的保鲜方法包括低温保鲜和化学保鲜，但保鲜效果欠佳，对采后致腐菌的抑制针对性较弱，且化学保鲜剂可能产生对人体有害的化学残留.因此，本研究探究柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌的抑制效果，通过构建时间-抑菌模型预测柠檬酸的抑菌特性；进而从细胞膜通透性和完整性方面探究柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌的抑菌机制，最后通过扫描电镜观察细胞形态变化.本研究旨在探索一种安全、高效的采后食用菌致腐菌的防治方法.

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1主要试剂

柠檬酸、DMSO（上海源叶生物科技有限公司）；蛋白胨、酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯化钠、无水乙醇（天津市天力化学试剂有限公司）、PBS（pH 7.2-7.4，陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司）、戊二醛固定液（2.5%，上海麦克林生化科技有限公司）、叔丁醇（天津市科密欧化学试剂有限公司），上述试剂均为分析纯及生化试剂.

1.1.2菌株与培养基

肠杆菌属（Enterobacter sp.）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）细菌：均分离于采收后食用菌，经形态学和分子生物学鉴定后，保存于陕西科技大学微生物实验室.

LB培养基：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1.0%，pH 7.0.

1.1.3主要设备

DDS-307型电导率仪（上海佑科仪器仪表有限公司）；全波长扫描式多功能读数仪（赛默飞世尔科技有限公司）；SP-756PC紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；CTFD-10S型冷冻干燥机（青岛永合创信电子科技有限公司）；高分辨场发射扫描电镜（美国FEI）.

1.2实验方法

1.2.1制备菌液和柠檬酸母液

将肠杆菌和寡养单胞菌接种于液体LB培养基，33 ℃、150 rpm振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，PBS洗涤3次后重悬菌体备用.

将柠檬酸溶解于DMSO，配制成1 M柠檬酸-DMSO母液备用.

后续每组实验均重复三次，并以未加柠檬酸的菌液为对照组.

1.2.2柠檬酸的抑菌作用

（1）柠檬酸抑菌圈的测定

将适量菌液加入冷却至50 ℃左右的无菌LB固体培养基，混合均匀后倾注平板，凝固后往牛津杯中注入200 mM柠檬酸-DMSO溶液，以DMSO为对照.33 ℃培养18 h后，观察是否出现透明抑菌圈并测量直径.

（2）柠檬酸最小抑菌浓度的测定

无菌96孔板上设置LB液体培养基作为空白对照、肠杆菌和寡养单胞菌菌液作为阴性对照.并采用倍比稀释法使菌液中柠檬酸终浓度分别为100 mM、50 mM、25 mM、12.5 mM、6.25 mM、3.13 mM、1.57 mM、0.78 mM.在33 ℃恒溫培养18～24 h后采用全波长扫描式多功能读数仪测OD600，依据公式（1）计算抑菌率并判断柠檬酸的最小抑菌浓度.

抑菌率=对照组-处理组/对照组×100%（1）

1.2.3柠檬酸时间-杀菌曲线的测定

取2 mL肠杆菌和寡养单胞菌菌液转移至小试管中，分别加入柠檬酸母液使各管终浓度为两种菌的0.5 MIC、MIC、2 MIC值.33 ℃恒温振荡培养，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h处取样，测OD₆₀₀.

1.2.4柠檬酸对菌液电导率的影响

将肠杆菌和寡养单胞菌菌液转移至无菌生理盐水中，分别加入柠檬酸使其终浓度为两种菌的0.5 MIC、MIC、2 MIC值.33 ℃恒温振荡培养，于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h处取样，8 000 r/min离心15 min，取上清液测电导率.

1.2.5菌体紫外吸收物的渗透检测

将肠杆菌和寡养单胞菌菌液转移至无菌PBS中，加入柠檬酸使其终浓度为两种菌的MIC值.33 ℃恒温振荡培养，于0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h时取样，4 000 r/min离心10 min，用0.22 μm滤器过滤上清液，检测上清液在260 nm、280 nm 处的吸光度.

1.2.6柠檬酸对细菌菌体形态的影响

分别取培养至2 h和24 h的MIC柠檬酸处理组的肠杆菌和寡养单胞菌菌液，离心收集菌体，PBS洗涤3次.2.5%戊二醛溶液固定2 h后，依次用30%，50%，70%，90%，100%乙醇梯度脱水，再用纯叔丁醇置换酒精3次，最后将细菌-叔丁醇混合液冷冻干燥，喷金，在扫描电镜下观察细菌的菌体形态.

1.3数据处理

采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计分析.p≤0.05代表有显著差异；p≤0.01代表有高度显著差异；p≤0.001代表有极显著差异.用Origin Pro 2018通过Logistic方程对柠檬酸的时间-抑菌曲线进行非线性拟合，并建立模型.Logistic方程如式（2）所示，Gd为相对生长下降百分比，a为Gd最大值，k为相对生长速率，xc为曲线拐点对应x值.如式（3）和（4）所示，μmax代表Gd的最大比增长速率，c代表柠檬酸抑菌的延滞时间.

2结果与讨论

2.1柠檬酸的抑菌作用

2.1.1柠檬酸的抑菌圈直径

柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌具有一定的抑制作用.经200 mM柠檬酸处理18 h，肠杆菌和寡养单胞菌的培养皿均出现明显抑菌圈，直径分别为1.57±0.03 cm，1.93±0.03 cm（图1），极显著大于对照组（p＜0.001）.柠檬酸对寡养单胞菌的抑制作用极显著大于对肠杆菌的抑制作用（p＜0.001），且培养过程中抑菌圈最大可达到2.47±0.03 cm.

2.1.2柠檬酸的最小抑菌浓度

MIC60是指柠檬酸对细菌生长的抑制率达到60%时的最低浓度.柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌的MIC60分别为100 mM和50 mM（图2），说明寡养单胞菌对柠檬酸的处理更敏感.

2.1.3柠檬酸时间-抑菌模型的建立

作用时间越久，柠檬酸抑制肠杆菌和寡养单胞菌所需的延滞时间越短，抑制效果越明显（图3）.根据Logistic方程建立的时间-抑菌模型中，100 mM柠檬酸抑制肠杆菌的最高相对生长下降百分比为36.93±1.58%，延滞时间为3.83 h，最大比增长速率为0.04 mM-1，模型方程为Gd=36.93/（1+exp（-0.29×（x-7.27））（图3（a））.50 mM柠檬酸抑制寡养单胞菌的最高相对生长下降百分比为80.37±3.96%，延滞时间分别为1.89 h，最大比增长速率为0.08 mM-1，模型方程为Gd=80.37/（1+exp（-0.26×（x-5.77）））（图3（b））.上述模型的R2均大于94%，说明拟合效果良好（表1）.其中，25 mM柠檬酸抑制寡养单胞菌的效果欠佳，12 h后抑菌效果逐渐降低，导致其时间-抑菌曲线不符合传统的微生物“S”型生长曲线，因此没有选择该浓度建立模型.

2.2柠檬酸的抑菌机理

2.2.1柠檬酸对菌液电导率的影响

菌液电导率与柠檬酸的作用浓度呈正相关，且具有时间依赖性（图4）.浓度越大，菌液的电导率越大，细胞膜的通透性越大.200 mM柠檬酸处理6 h后，肠杆菌菌液的电导率最高达6.07±0.01 ms/cm，极显著高于0 h电导率（p≤0.001），说明6 h后，肠杆菌细胞膜通透性显著提高.而50 mM柠檬酸处理组12 h后电导率才达到最高，仅为4.93±0.01 ms/cm，明显低于200 mM柠檬酸处理组（图4（a））.寡养单胞菌菌液的电导率变化情况和肠杆菌基本一致（图4（b））.有机酸通常可以降低环境pH、破坏渗透压、造成细胞膜损伤，从而抑制或杀死病原菌.细胞膜发生损伤后，胞内Na⁺、K⁺等电解质大量外流，体系电导率升高，细胞膜通透性增大.

2.2.2柠檬酸对菌体紫外吸收渗透的影响

260 nm和280 nm分别是核酸和蛋白质的最大吸收峰，因此可通过OD260和OD280来表征胞外核酸和蛋白质的泄露情况.肠杆菌的核酸、蛋白质泄露量明显多于寡养单胞菌，而泄露量显著增大的时间晚于寡养单胞菌（图5）.经柠檬酸处理2 h后，肠杆菌的核酸泄露量迅速增大，且显著大于0 h，最大增至0.065±0.001.4 h后肠杆菌的蛋白泄漏量才开始迅速增大，6 h时达到最大0.046±0.001（图5（a））.对寡养单胞菌，0.5 h时核酸泄漏量已经显著大于0 h，4 h时达到最大0.036±0；蛋白泄漏量在6 h时达到最大0.023±0（图5（b））.细胞膜受损后，完整性被破坏，胞内核酸、蛋白质等大分子随之泄露到胞外.

2.2.3檸檬酸对菌体细胞形态的影响

对照组的肠杆菌呈短杆状，菌体表面光滑完整（图6（a））.经100 mM柠檬酸处理，2 h后肠杆菌部分菌体表面出现褶皱（图6（c）），24 h后大部分菌体表面凹凸不平，菌体不再光滑饱满，出现塌陷（图6（e））.对照组的寡养单胞菌呈长杆状，菌体光滑完整（图6（b））.经50 mM柠檬酸处理，2 h后寡养单胞菌部分菌体表面凹凸不平（图6（d）），24 h后几乎所有菌体表面粗糙，出现褶皱、弯曲，并明显发生破损（图6（f））.通过高分辨场发射扫描电镜可以直观地观察到柠檬酸处理破坏了菌体形态.这与上述菌液电导率和胞外核酸、蛋白质泄露情况的结果一致，证明柠檬酸处理改变了细胞膜通透性和完整性，破坏了菌体形态.

3结论

柠檬酸对肠杆菌和寡养单胞菌具有一定的抑制作用.在最小抑菌浓度下，根据Logistic方程建立的时间-抑菌模型预测肠杆菌和寡养单胞菌的最高相对生长下降比分别为36.93±1.58%和80.37±3.96%.柠檬酸通过改变细胞膜通透性、完整性导致细胞膜受损，胞内电解质外流，核酸、蛋白质等大分子外泄，抑制菌体生长甚至死亡.本研究为柠檬酸安全防治食用菌致腐菌的应用提供数据支撑，为开发食用菌天然保鲜剂奠定理论基础.本文抑菌机制的研究重点关注了柠檬酸对腐败菌细胞膜的影响，后续可以从细胞壁、能量代谢、蛋白质合成等方面全面探究柠檬酸的抑菌机制.

参考文献

［1］ 王琼英，高巍，赵梦然，等.市售食用菌鲜品外源细菌的动态变化分析［J］.食品科学，2017，38（21）：80-85.

［2］ 赵慧.平菇黄斑病病原菌的分离鉴定、侵染机制与生物防治研究［D］.太原：山西农业大学，2019.

［3］ 高梦雅.噬菌体的筛选及其应用于食用菌保鲜的研究［D］.天津：天津科技大学，2020.

［4］ 安花弘，邓冰，常明昌，等.双孢菇采后贮藏期间表面微生物菌群结构及优势腐败菌研究［J］.食品科技，2020，45（12）：23-30.

［5］ Wang X，Liu S，Chen M，et al.Low temperature （15 ℃） reduces bacterial diversity and prolongs the preservation time of Volvariella volvacea［J］.Microorganisms，2019，7（10）：475.

［6］ 柴红梅，张小雷，赵永昌，等.一种假单胞菌Pseudomonas sp.导致的侧耳属细菌病害［J］.中国食用菌，2019，38（11）：95-97，112.

［7］ 牛耀星.不同温度下金针菇优势腐败细菌分析及其货架期预测模型的构建［D］.兰州：甘肃农业大学，2020.

［8］ 姚璐晔，沈金波，裴丹丹，等.杏鲍菇生产包黑斑病害菌分析［J］.食品研究与开发，2016，37（1）：190-194.

［9］ 王琼英.市售食用菌鲜品外源细菌多样性研究及乳球菌快速检测方法的建立［D］.北京：中国农业科学院，2017.

［10］ 杨国辉，江丹霞，武少兰，等.聚赖氨酸联合1-MCP处理对草菇保鲜效果的影响［J］.菌物学报，2021，40（12）：3 347-3 359.

［11］ 阿不都外力·阿不都热依木，孙磊，古丽斯玛依·艾拜都拉，等.冬季贮存甜瓜腐烂病原菌的分离与鉴定［J］.食品科学，2010，31（17）：250-253.

［12］ 杨秋月.芽苗菜优势腐败菌生长规律及控制技术研究［D］.天津：天津科技大學，2013.

［13］ 黄永平，黄占旺，万亮，等.应用表型和基因型分析28 ℃鲜湿米粉中主要优势菌［J］.食品工业科技，2017，38（17）：99-104，10.

［14］ 房武.豆制品中腐败菌烈性噬菌体分离鉴定及其抑菌作用研究［D］.扬州：扬州大学，2019.

［15］ Meng D M，Sun S N，Shi L Y，et al.Application of antimicrobial peptide mytichitin-CB in pork preservation during cold storage［J］.Food Control，2021，125（1）：108 041.

［16］ Wu J，Ding Z，Diao Y，et al.First report on Enterobacter sp.causing soft rot of Amorphophallus konjac in China［J］.J.Gen.Plant Pathol.，2011，77（5）：312-314.

［17］ Razanakoto L M，Massart S，Clerck C D，et al.First report on the occurrence of Enterobacter sp.causing leaf dieback and wilt of potato in Madagascar［J］.New Disease Reports，2015，32：34.

［18］ Zhou Y，Yang H，Liu J.Complete genome sequence of Enterobacter roggenkampii strain KQ-01，isolated from bacterial Wilt-Resistant Mulberry Cultivar YS283［J］.Plant Dis.，2020，105（3）：688-690.

［19］ 邓阳，姜竹鸣，张玉琴.寡养单胞菌属细菌的研究进展［J］.生物资源，2021，43（1）：1-9.

［20］ 罗婵.Nisin、柠檬酸及双乙酸钠在鲜切生菜清洗过程中的应用研究［D］.雅安：四川农业大学，2014.

［21］ 钱红玫，胡文忠，李琳，等.乳酸链球菌素和柠檬酸对甜樱桃中沙门氏菌的抑制［J］.食品工业科技，2017，38（15）：275-279.

［22］ 石玉新，马艳丽，齐树亭.柠檬酸、Nisin-柠檬酸联合对三种常见水产病原菌的作用［J］.河北渔业，2006（9）：17-21.

【责任编辑：蒋亚儒】