乳及乳制品中羊乳铁蛋白含量的电泳迁移检测

王云娜　何悦　孙娜娜　黄锐　徐秦峰

摘要：乳铁蛋白（Lactoferrin）是一种广泛存在于哺乳动物外分泌液中的天然非血红素铁结合蛋白，具有多种生理活性应用于乳制品.羊乳营养组成更加趋近于人乳，以羊乳为基底物的“全羊”配方产品具有更广阔的市场诉求，对其乳铁蛋白的来源及含量监督有助于推动乳品“母乳化”研究的不断发展，对羊乳基婴幼儿配方乳粉的开发研究有重大的指导意义.研究利用DNA序列与羊乳铁蛋白的特异性结合，采集凝胶成像图中GLF-DNA序列复合物条带的灰度值，建立了一种简便、快速检测乳及乳制品中羊乳铁蛋白含量的电泳迁移技术.结果表明，该方法结果准确、操作简单，适用于乳及乳制品中羊乳铁蛋白含量检测，可以为特色生鲜乳中乳铁蛋白检测和营养价值评估提供参考.

关键词：羊乳铁蛋白检测； 电泳迁移技术； DNA序列； 荧光标记

中图分类号：TS252文献标志码： A

Determination of goat lactoferrin in milk and

dairy products by electrophoretic mobility shift assay

WANG Yun-na HE Yue SUN Na-na HUANG Rui XU Qin-feng（1.School of Food Science and Engineering， National R & D Center for Goat Dairy Products Processing Technology， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China； 2.Zhongken Huashan Mu Dairy Co.， Ltd.， Weinan 714000， China）

Abstract：Lactoferrin is a natural non-heme iron-binding glycoprotein widely found in mammalian exudate，which has a variety of physiological activities and has been applied to dairy products.The nutritional composition of goat milk is more similar to human milk.The ″whole sheep″ formula based on goat milk has a broader market appeal.The supervision of the source and content of lactoferrin is helpful to promote the continuous development of the research on ″breast milk″ of dairy products，and has great guiding significance for the development and research of goat milk based infant formula milk powder.In this study，a simple and rapid electrophoretic migration technique was established to detect the content of goat lactoferrin in dairy products by using the specific binding of DNA sequence and GLF-DNA sequence complex band in gel imaging images.The results show that the method is accurate，simple and suitable for the detection of goat lactoferrin in dairy products，and could provide a reference for the detection of goat lactoferrin in characteristic fresh milk and the evaluation of nutritional value.

Key words：detection of goat lactoferrin； electrophoretic mobility shfit assay； DNA sequence； fluorescent labeled

0引言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一种广泛存在于哺乳动物外分泌液中的天然非血红素铁结合蛋白［1］.我国的优质乳工程已经把乳铁蛋白含量作为评价优质乳的重要参考指标之一.已有大量研究证实，乳铁蛋白具有多种对人体有益的生理活性，最常见的包括广谱抗菌活性、抗病毒功能，铁转运以及维持人体铁平衡等可以作为营养强化剂用于乳制品及保健食品中［2-5］.

国内外对乳铁蛋白含量检测已有很大进展，GB 1903.17-2016《食品安全国家标准 食品营养强化剂 乳铁蛋白》中仅针对乳及其制品为原料制得的LF原料的检测，并不能用于食品中LF检测，对食品中乳铁蛋白检测通常有免疫法［6-8］、色谱法［9-11］及电泳法［12-14］.羊乳含有羊乳铁蛋白等多种营养物质，致敏性较低，蛋白组成更加接近人乳，得到了越来越广泛的应用［15］.以羊乳为基底物的配方产品，比如羊乳清蛋白研制的“全羊”婴幼儿配方奶粉会有更大的市场诉求，需要我们对其配方中乳清蛋白来源及含量评估及监督，使得“全羊配方”成为可能［16］.

例如，免疫法特异性强，灵敏度高，但需要考虑乳铁蛋白的活性，避免加工工艺的影响.王玉堂等［17］开发了羊乳中乳铁蛋白的高效液相色谱测定方法分析羊乳中乳铁蛋白的分布规律，结果准确，但对样品的纯度要求较高，样品前处理繁琐.田荣荣等［18］利用高效液相色谱-串联质谱法检测不同来源乳中乳铁蛋白的含量，灵敏度高，可实现微量检测，但仪器昂贵，对操作人员要求较高.电泳法操作简单，分离效果好，但容易受检测条件及毛细管吸附作用的影响.

近年来，适配体与靶标蛋白具有高特异性和亲和力，更加适用于复杂样品体系中乳铁蛋白含量的检测.孙娜娜等［19］利用核酸适配体和LF的特异性结合，引起的游离核酸适配体的峰面积大小和LF浓度的线性变化，对乳制品中乳铁蛋白进行检测，操作简便，但只能间接定量.黄锐等［20］基于DNA序列和LF-DNA复合物凝胶电泳迁移率差异，通过复合物的荧光值和蛋白的浓度关系实现LF检测，操作简单，无需大型仪器.以上电泳方法均是针对牛乳铁蛋白定性定量分析，缺乏对羊乳铁蛋白的检测.

本研究采用凝胶电泳迁移法测定乳及乳制品中羊乳铁蛋白含量，灵敏度高、成本低且不需要复杂的前处理，希望为特色乳的营养价值评估提供参考及食品加工提供数据基础和技术思路.

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.1.1主要试剂

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG） 纯度≥90%、α-乳白蛋白（α-lactabumin，α-Lac） 纯度≥85%、酪蛋白（Casein）纯度≥90%，均购买自Sigma-Aldrich；羊乳铁蛋白（goat lactoferrin，GLF） 纯度≥85%（优博）；100 μM FAM-DNA序列（5′- GCA GGA CAC CGT AAC AAT ACT CCT GTT ACC GTG CAT CTA TGG CCA TTG GCT TTT CCT GC-3′（FAM））；DL500 bp DNA marker（Takara）；PBS粉末（Sigma公司）；分子生物级琼脂糖（Thermo Fisher Scientific）；Molecular Biology Grade 50×TAE buffer（上海生工生物工程公司）；SYBR Gold染料（Invitrogen）.

1.1.2主要仪器

5424R高速冷冻离心机（Eppendorf）；MYSPIN12微型离心机（Thermo Fisher Scientific）；VORTEX2涡旋振荡器（IKA）；DK-8D恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；PowerPacTM Basic琼脂糖水平电泳仪（BIO-RAD）；VE0100 B-BOX 蓝光透射仪（SMOBIO）；M1-L213B 21L微波炉（美的）.

1.2实验材料

婴幼儿配方羊乳粉（不含乳铁蛋白）购买于当地市场，常温储存；鲜羊乳购买于当地牧场，4 ℃储存.

1.3检测方法

（1）DNA序列前处理：DNA序列储备液用1×PBS稀释至一定浓度，退火处理后保存至冰箱冷却备用.

（2）琼脂糖凝胶电泳：将退火后的核酸适配体加入稀释至一定浓度的乳铁蛋白标准溶液或含一定量乳铁蛋白的待测样品，用1×PBS调整终体积为20 μL，孵育一定时间，在样品中加入4 μL甘油上样液后进行电泳.电泳参数：1%的琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，电压为100 V，电泳时间为25 min.电泳结束后使用蓝光透射仪观察电泳结果.使用数据处理软件WCIF Image J采集条带灰度值，将得出的数据值导入QriginPro生成结果图.

1.4实际样品检测

（1）实际样品前处理：鲜羊乳在4 ℃，12 000 r/min离心处理10 min，取中间层；羊奶粉溶解方式为称取1 g奶粉用超纯水定容至7 mL，4 ℃，12 000 r/min离心处理10 min，取中间层.

（2）实际样品检测：用所建立的检测GLF的方法，分別检测鲜羊乳、羊奶粉中GLF含量.在实际样品中加入GLF标准品进行加标回收检测.

2结果与讨论

2.1凝胶电泳迁移法检测乳铁蛋白可行性

凝胶电泳迁移法是根据带电粒子在电场作用下的迁移率，研究核酸结合蛋白和相关核酸互相作用的技术，能够实现蛋白质和核酸的定性定量分析［21］.牛羊乳铁蛋白相同氨基酸序列达92.23%，杨博睿等［22］通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验发现GLF相较BLF条带位置更加偏上，两种蛋白有明显的不同.通过比较蛋白-核酸复合物和游离核酸的电泳迁移率差异，来判断GLF是否发生特异性结合.乳制品中含有多种组分，包括酪蛋白及其他乳清蛋白.将单独的DNA序列分别与乳制品中几种主要的乳清蛋白α-Lac、β-LG、Casein、GLF标准品的混合液进行琼脂糖凝胶电泳.

如图1所示，1～4号泳道中只观察到游离适配体的条带，表明该DNA序列不会与α-Lac、β-LG、Casein等乳蛋白产生非特异性结合.而在5号泳道中观察到明显的DNA-GLF复合物条带且迁移率低于游离适配体，同时未结合的DNA序列灰度值明显降低.说明只有GLF能与适配体结合形成复合物.该实验可以说明凝胶电泳迁移法可以特异性检测GLF.

2.2实验条件优化

2.2.1Mg2+浓度优化

研究表明，核酸适配体的分支点处未配对的核苷酸和二价金属离子能通过促进两个螺旋之间的结构转变来稳定DNA三向接合结构，且适当的Mg²⁺浓度能使适配体的二级结构更加稳定［23-25］.为提高凝胶电泳迁移法检测GLF的性能，需要对GLF中Mg²⁺进行优化.将单独的核酸适配体与DNA-GLF复合物在0～4 mM浓度范围的Mg²⁺下进行优化，以获得GLF检测性能最佳的Mg²⁺浓度［26］.

电泳结果如图2（a）所示.采集GLF-DNA序列复合物条带的灰度值，比较不同浓度Mg²⁺下复合物灰度值与空白组差值（如图2（b）所示）可知，当Mg²⁺的终浓度为1 mM时，测得的灰度值与空白组差值较大，说明此时Mg²⁺的浓度已经对GLF-DNA序列起到稳定作用，电泳效果较好，利于检测.因此，将Mg²⁺终浓度为1 mM作为后续的实验条件.

2.2.2孵育时间优化

合适的孵育时间能够保证核酸适配体与GLF的有效结合，提高结果的准确性.在一小时内，随着孵育时间增长，复合物条带的灰度值如图3（a）所示先增加后降低，结合不同孵育时间下复合物灰度值与空白组差值分析，可以看出孵育时间10 min时复合物的灰度值与空白组差值最大（如图3（b）所示），说明此时羊乳铁蛋白与核酸适配体充分结合，检测效果最佳，结合乳铁蛋白核酸适配体的最佳孵育温度37 ℃［27］，将孵育时间10 min作为后续实验条件.

2.2.3胶浓度优化

琼脂糖凝胶浓度大小影响复合物的分离效果，胶浓度不同时，GLF-DNA序列复合物的条带分辨率与亮度存在差异，优化胶浓度有利于实验结果的准确性.

相同样品和电流条件下，分别设置1%、2%、4%胶浓度进行GLF检测，对电泳结果进行比较.采集复合物条带的灰度值制作标准曲线计算线性回归系数R²（如表1所示）.当胶浓度为1%时，复合物受到的阻碍作用较小，分离效果差，当胶浓度为2%和4%时，R²接近1，线性关系良好，复合物条带清晰、明亮，有利于灰度值采集.对羊奶粉中GLF检测，当胶浓度为4%时加标回收率为106.7%.原因可能是琼脂糖凝胶浓度越高，孔径越小，能够更好的消除掉实际样品中其它结构复杂的大分子物质影响，如乳铁蛋白与酪蛋白胶体、乳球蛋白形成的复合物等［28］.因此，选择4%胶浓度更适用实际样品中GLF的定性定量分析.

2.3实验方法灵敏度验证

为将所建立的凝胶电泳迁移技术用于实际样品中的GLF检测，条件优化后，在相同浓度的核酸适配体中加入梯度设置GLF浓度进行灵敏度验证，其结果如图4所示.由图4（a）可知，随着乳铁蛋白浓度增加，复合物条带的灰度值增加，下方游离适配体条带的灰度值降低.采集复合物条带的灰度值经计算与GLF浓度呈现良好的线性关系y=69.4+0.041x，线性回归系数R²=0.989 6，实验的灵敏度较高，可以根据GLF浓度依赖GLF-DNA序列条带的灰度值改变对GLF进行定性定量检测（如图4（b）所示）.

2.4实际样品检测

将所建立的乳铁蛋白含量检测方法应用于羊奶粉和鲜羊奶中，其检测结果如图5及表2所示.采集鲜羊奶电泳结果（如图5（a）所示）中不同浓度GLF-DNA序列复合物的灰度值制作标准曲线，标准曲线方程为y=25.916 6+0.118 81x，线性回归系数R²=0.974 7，对实际样品加标后得出回收率92.6%，具有较好的灵敏度和准确性.鲜羊奶检测出乳铁蛋白含量为0.13 mg/mL，与报道的0.08～0.15 mg/mL相符［16］.对羊奶粉进行同样的处理（如图5（b）所示），得到标准曲线方程为y=39.392+0.139 6x，线性回归系数R²=0.974 7，加标回收率分别为93.1%和91.9%.表明本研究建立的凝胶电泳迁移技术可以实现乳及乳制品中羊乳铁蛋白的定性定量检测.

3结论

本研究利用凝胶电泳迁移技术建立了一种乳及乳制品中GLF含量的检测方法.该方法利用GLF与核酸适配体形成复合物，通过琼脂糖凝胶电泳，优化实验条件后采集复合物条带的灰度值，依据灰度值与乳铁蛋白含量的线性关系，实现乳制品中GLF定量检测.该方法特异性强，灵敏度高，样品仅需要进行简单的稀释、离心处理，可以为乳及乳制品中羊乳铁蛋白的检测提供参考及特色乳的生产加工工艺控制提供技术支持.

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