基于生物信息数据分析miR-655-3p在肝癌中的表达及其可能的调控机制

苏倩　李小丽　张忠山　王栋洋

摘 要：目的 探討miR-655-3p在肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）中的表达及其可能参与的生物学过程和信号通路，为进一步研究miR-655-3p的调控机制及生物学功能提供理论依据。方法 初步分析miR-655-3p在肝癌中的表达情况；借助多个数据库预测并筛选靶基因，随后对获取的靶基因进行GO功能富集和KEGG富集分析；构建靶蛋白互作网络并筛选网络中的核心基因，最后验证分析核心基因在肝癌中的表达及它们与临床分期、预后的关系。结果 miR-655-3p在肝癌组织中呈低表达，经筛选获得miR-655-3p相关靶基因153个。这些靶基因主要与RNA聚合酶II启动子转录调控、血管发育、衰老、凋亡调控等生物学过程以及神经营养因子、Rap1、MAPK等信号通路相关。蛋白互作网络中筛选的10个核心基因，仅RAC1表达水平在LIHC组织中显著上调，且与肝癌患者的临床分期和总生存期（overall surviral，OS）相关。结论 miR-655-3p在肝癌相关的生物学过程中起重要作用，可能与筛选的靶基因RAC1表达上调有关。

关键词：肝癌；miR-655-3p；生物信息；靶基因

中图分类号：R735.7

文献标志码：A

Expression and its possible regulatory mechanism of miR-655-3p in hepatocellular carcinoma based on bioinformatics

SU Qian LI Xiaoli ZHANG Zhongshan WANG Dongyang

（1. Departmet of Oncology， The Affiliated Hospital of Xiangnan University， Chenzhou 423000， China； 2. Clinical College of Xiangnan University， Chenzhou 423000， China）

Abstract： Objective To expore the expression and its possible biological processes and signaling pathways of miR-655-3p in hepatocellular carcinoma were discussed， and to provides theoretical basis for further study on the regulatory mechanism and biological function of miR-655-3p. Methods The expression of miR-655-3p in hepatocellular carcinoma tissues was preliminarily analyzed. Multiple databases were applied to predict and screen the target genes. Subsequently， GO functional enrichment and KEGG enrichment analysis were performed on the obtained target genes. Furthermore， the target protein interaction network was constructed and core genes in the network were screened. Finally， the expression of core genes in LIHC and their relationship with clinical stage and prognosis were verified and analyzed. Results miR-655-3p was low-expressed in hepatocellular carcinoma tissues. A total of 153 target genes related to miR-655-3p were screened in multiple databases. These target genes were mainly involved in transcriptional regulation of RNA polymerase II promoter， vascular development， aging， apoptosis regulation and other biological processes， as well as neurotrophin， Rap1， MAPK and other signaling pathways. Among the 10 core genes screened in the protein interaction network， only RAC1 expression level was significantly upregulated in hepatocellular carcinoma tissues and correlated with clinical stage and overall survival （OS） of patients. Conclusion miR-655-3p plays an important regulatory role in the biological process related to hepatocellular carcinoma， which may be related to the upregulation of the screened target gene RAC1 expression.

Key words： hepatocellular carcinoma; miR-655-3p; bioinformatics; target gene

MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码小RNA，它们在人类基因表达调控中起非常重要的作用。近年来，研究发现较多的miRNAs与人类肿瘤密切相关[1]。已有研究表明，miR-655（miR-655-3p）广泛参与了肿瘤的恶性生物學行为，在肿瘤发生进展中扮演抑癌基因的角色[2]。在卵巢癌的研究中显示，miR-655-3p通过靶向调控RAB1A抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。miR-655在三阴性乳腺癌中下调PRRX1抑制肿瘤细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）表型的获得，从而抑制癌症进展过程中的细胞迁移和侵袭能力。KIUCHI等[3]发现血浆中低表达的miR-655与食管鳞状上皮癌患者的淋巴浸润和不良预后显著相关，且证实miR-655在食管鳞状上皮癌细胞中具有肿瘤抑制功能。虽然有一些研究报道了miR-655的生物学功能，但关于它在肿瘤中的研究仍较少，其具体机制，特别是在肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）中的机制仍缺乏深入的研究。因此，本研究旨在阐明miR-655-3p在LIHC中潜在的生物学作用，并分析其可能的调控机制，为进一步明确miR-655-3p在LIHC中的作用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 基于OncomiR数据库分析miR-655-3p在LIHC中的表达

OncomiR（http：//www.oncomir.org）是一个可用于探索癌症中miRNA表达失调的在线资源平台。从OncomiR数据库中下载与LIHC组织相关的miR-655-3p表达数据，分析在LIHC组织与正常肝组织之间miR-655-3p的表达情况。

1.2 筛选miR-655-3p靶基因

利用miRWalk（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de）、miRDB（http：//mirdb.org）和TargetScan 8.0（http：//www. targetscan.org）3种靶基因预测工具筛选miR-655-3p靶基因。使用韦恩工具将3个数据库预测结果绘制韦恩图，取交集。从miRTarBase数据库（https：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/）中提取经实验证实的miR-655-3p靶基因。将两者数据合并，作为靶基因集合用于后续分析。

1.3 靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库对获取的miR-655-3p相关靶基因集进行GO功能和KEGG通路富集分析。其中，功能注释分析包含了生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个组分。以P＜0.05为标准获取具有统计学差异的功能分析和信号转导通路数据，最终选取排名前十位数据结果绘制成条形图或气泡图。

1.4 构建蛋白互作（PPI）网络及筛选核心基因

将miR-655-3p靶基因对应的蛋白质名称依次输入STRING（https：//cn.string-db. org/）数据库，构建miR-655-3p相关靶基因PPI网络，隐藏网络中与其他蛋白质无任何连接的节点。将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1软件进一步分析，利用CytoHubba插件与MCC算法计算每个基因节点的分值，筛选出排名前十位的基因，即为核心（hub）基因。

1.5 验证核心基因在LIHC组织中的表达及与临床分期、预后的关系

利用GEPIA工具（http：//gepia.cancer-pku.cn）分析验证PPI网络中的核心基因在LIHC组织和正常肝组织中的表达差异。进一步探索这些核心基因与LIHC临床分期的关系及对患者生存预后的影响。

2 结果

2.1 miR-655-3p在LIHC组织及相应正常组织中的表达情况

hsa-miR-655-3p在LIHC组织中的表达水平显著低于正常组织（P<0.05，表1）。

2.2 miR-655-3p靶基因的筛选

通过miRWalk、miRDB和Targetscan 3种软件预测miR-655-3p的靶基因数分别为1 327、1 294和850个，取交集获得靶基因有65个（图1A）。从miRTarBase数据库中查询的已通过实验证实的靶基因有93个，其中有5个靶基因（ATAD2、MAGI2、SLC35F5、ELK4、CANX）与上述预测靶基因交集重叠，最终共获得153个候选靶基因用于后续分析（图1B）。

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析

运用 DAVID 数据库对153个筛选靶基因进行功能及通路富集分析。GO分析结果显示，miR-655-3p靶基因主要参与RNA聚合酶II启动子转录调控、神经元迁移、血管形成、衰老、凋亡调控等过程；在细胞组分方面，miR-655-3p靶基因主要集中于细胞核、核染质、核质、细胞质以及胞液等；在分子功能方面， 主要富集于RNA聚合酶II转录调控区序列特异性结合、RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性DNA结合、序列特异性DNA结合以及蛋白质的结合功能等（图2A）。KEGG信号通路富集分析显示，这些靶基因主要富集在人类T细胞白血病病毒1型感染、神经营养因子、Rap1以及MAPK等相关信号通路（图2B）。

2.4 miR-655-3p靶基因PPI网络构建及核心基因筛选

利用STRING数据库对miR-655-3p相关靶基因构建好PPI网络，导入 Cytoscape软件进行可视化，利用CytoHubba插件借助于MCC算法，最终筛选前十位的基因作为潜在的核心基因。分别是JUN（30）、FOXO1（19）、ZEB1（18）、SRF（11）、RAC1（10）、POU2F1（9）、BPTF（8）、ABT1（6）、GNL3（6）、UTP15（6）（圖3）。

2.5 验证核心基因在LIHC中的表达和意义

GEPIA表达分析显示，10个筛选的核心基因中仅RAC1表达水平在LIHC组织中明显高于正常肝组织，具有统计学意义（P<0.05，图4）。进一步通过GEPIA对RAC1与LIHC患者病理分期的相关性进行单因素方差分析，结果显示RAC1与LIHC的病理分期显著相关，差异亦有统计学意义（P<0.05，图5）。生存分析显示，RAC1高表达的LIHC患者总生存时间（overall survival，OS）短于RAC1低表达的LIHC患者（P<0.05，图6），提示RAC1表达水平升高，LIHC患者总体预后更差。

3 讨论

原发性肝癌是全球第六大常见癌症，在所有癌症中病死率居第3位，对人体生命和健康造成了极大威胁[4]。当前，肝癌在我国的发病率和病死率也较高，已成为严重威胁我国居民健康的重大疾病[5]。尽管目前肝癌的治疗手段多种多样，然而其发生发展机制尚未完全阐明，针对中晚期肝癌的有效手段依然缺乏。深入探究和鉴定出肝癌发生发展过程中更多失调的miRNAs，进一步明确它们的生物学功能及作用机制，对肝癌患者的有效治疗和预后评价具有极其重要的现实意义。

miR-655定位于人染色体14q32上。较多文献资料显示，miR-655参与并影响着多种肿瘤的恶性生物学行为。例如，miR-655-3p在肺腺癌细胞系中呈低表达，miR-655-3p过表达可靶向调控KIF20A抑制肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭，这种抑癌效应可能与抑制RAS/MAPK通路有关[6]。另一研究发现miR-655在人口腔鳞状细胞癌细胞系过表达后可减弱肿瘤细胞的增殖和侵袭能力[7]。杨明环等[8]发现miR-655-3p通过靶向抑制TRIM59的表达，从而抑制神经胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力且诱导细胞凋亡。在肝细胞癌中，ADAM10被确定为miR-655-3p的直接靶点，miR-655-3p可能通过调节ADAM10和β-catenin通路在肿瘤发生发展过程中发挥抑癌作用[9]。这说明miR-655-3p （miR-655） 在较多恶性肿瘤进展中发挥重要作用，但其作用靶点及调控机制可能完全不同。当前，miR-655-3p在LIHC中的意义及其可能调控机制尚未完全阐明，可能有多个靶点及多条信号通路参与其中。

本研究基于OncomiR数据库分析发现在LIHC组织中miR-655-3p表达水平显著低于正常肝组织。有关研究结果也表明，miR-655-3p在LIHC组织和细胞系中显著下调[9-10]，所以，推测表达下调的miR-655-3p在肝肿瘤发生发展中具有潜在重要功能。为了进一步挖掘 miR-655-3p影响LIHC发生发展的作用机制，利用生物信息相关软件对miR-655-3p下游靶基因进行预测及筛选。功能和信号通路富集分析发现这些靶基因主要富集于RNA聚合酶II启动子转录、血管形成、衰老、凋亡等生物学过程的调控以及Rap1、MAPK等相关信号通路。血管形成是肿瘤发生、生长、浸润与转移的重要条件，而细胞凋亡异常在肿瘤发生发展中亦占有重要地位。肿瘤的发生发展也会与细胞内信息转导异常密切相关。如Rap1在细胞增殖、转移、血管生成等方面发挥关键作用[11]。MAPK信号通路在许多肿瘤中常被激活，其多种成分已被确定为致癌基因。多项研究表明，MAPK信号通路的异常改变与癌症有很强的相关性，其中包括结直肠癌[12]、胰腺癌[13]和LIHC[14]等。而MAPK信号通路在LIHC细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等环节中发挥重要的调节作用[15]。因此，从生物信息学分析角度而言，miR-655-3p可能通过调控一些关键基因影响生物学过程（和）或信号通路，从而在抑制肿瘤形成进展过程中发挥重要功能。

PPI网络构建及hub基因筛选推测出JUN、FOXO1、ZEB1、SRF及RAC1等基因是miR-655-3p参与LIHC生物学过程的关键基因。研究进一步发现，在这些关键基因中仅RAC1基因在LIHC组织中呈高表达，且与LIHC患者的临床分期密切相关，这意味着高表达的RAC1在LIHC发生发展中可能具有极其重要的意义。生存分析也提示RAC1高表达可能与LIHC患者的不良预后有关，其表达水平的高低对LIHC患者的临床预后判断和评估具有一定的参考价值。RAC1（Ras相关的C3肉毒素底物1）是Rho GTPase家族中的重要成员，对人类机体细胞的许多生理活动的完成至关重要，比如吞噬、黏附、运动、迁移及细胞增殖等。此外，已报道RAC1与多数癌症有关，在血管生成、肿瘤侵袭和迁移中起重要作用。RAC1基因多被认为是一种促进人类癌症恶性转化和进展的癌基因，其活性和表达异常与肿瘤发生、存活、耐药性、转移等肿瘤特性密切相关[16]。RAC1在LIHC细胞的增殖、肿瘤转移和耐药方面发挥关键作用，间接或直接靶向RAC1小分子已在LIHC实验模型中显示出抗癌效应，过度表达或过度激活的RAC1有望作为治疗LIHC的靶点[17]。研究发现miR-655-3p预测筛选的关键靶基因RAC1与肿瘤LIHC患者不良预后显著相关，推测miR-655-3p 在LIHC发生发展中的重要作用可能与其调控的PPI网络中的核心基因RAC1有关。

综上所述，通过生物信息数据分析发现miR-655-3p 可能通过调节RAC1基因影响LIHC的发生、发展和转归，能为后期深入研究miR-655-3p在LIHC中的调控机制及寻找新靶点提供理论依据。

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