基于模式识别技术结合UPLC的西红花产地鉴别

管彬彬，熊金恩，李克庆，朱琳，蒋凡

南通市食品药品监督检验中心（南通 226006）

西红花为鸢尾科植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，是一种名贵的药食同源产品，用途广泛，在一些欧洲国家，如法国、西班牙、希腊等地区，西红花常被作为不可或缺的食品添加剂和香料。在中国，西红花是特别珍贵的中药材和膳食材料，具有活血化瘀、解郁安神、凉血解毒等功效，其有效成分包括西红花苷、苦番红花素和藏红花醛等[1-3]。其中西红花苷是西红花色泽主要来源，具有活血、养颜、降血脂等作用；苦番红花素是西红花的主要呈味物质，具有消炎、抗肿瘤等作用；藏红花醛是西红花香气的主要来源，具有缓解心肌损伤、抗氧化应激等作用[4-6]。以上几种成分赋予西红花明媚的色彩、独特的香气和味道，集观赏、药用和经济价值于一身。

因为药材在某一地域特定的自然生态环境下，加之较为集中的栽培、生产、加工技术，使其品质优良、疗效确切，因此中药素来有“道地药材”一说，产地的“道地性”在很大程度上也是中药材品质的保证[7-8]。西红花的原产地位于西亚中东地区，主要分布在地中海沿岸以及欧洲，再经印度到西藏传入我国，故又被称为“藏红花”或“番红花”。在20世纪80年代，我国进行了引种栽培，在上海、江苏、浙江以及河南等地实现了规模化的种植[9-11]。目前西红花在各个国家及地区都有规模化的培育和种植，但是也正是由于受到产地及种植方式等差异的影响，各产地的西红花药材品质和质量也存在差异[12-13]。此次研究以不同产地的西红花为研究对象，通过UPLC分离和检测其有效成分，结合模式识别，对产地进行区分。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

西红花样本分别购自于上海、江苏、浙江、伊朗、西藏5个地区，共29批，每批样品取3份，共87份样品，具体样品信息见表1。

Waters H-class超高效液相色谱系统（美国沃特斯）；KQ5200DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius CPA225D电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q Academic超纯水机（密理博上海公司）。

对照品西红花苷Ⅰ（批号111588-201704，含量以88.4%计）、西红花苷Ⅱ（批号111589-201705，含量以92.2%计）、苦番红花素（批号112056-202102，含量以97.3%计）：中国食品药品检定研究院；藏红花醛[纯度≥99.5%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]。

乙腈（默克股份有限公司）为色谱纯，乙酸（西陇科学股份有限公司）为优级纯，乙酸铵（西陇科学股份有限公司）、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）为分析纯，水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：35 ℃；流动相A为0.05 mol/L乙酸铵水溶液（含0.05%乙酸），流动相B为乙腈，流动相梯度程序见表2。

表2 流动相梯度程序

进样量为1 μL；西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的检测波长为440 nm，苦番红花素的检测波长为254 nm，藏红花醛的检测波长为308 nm[14-15]。

1.2.2 样品预处理

精密称取40 mg西红花药材粉末，置于100 mL棕色量瓶中，加入90 mL 70%乙醇水溶液，冰浴超声20 min后放至室温，再以初始流动相比例A-B（90∶10，V/V）定容，摇匀，用0.22 μm的有机滤膜过滤后即得。

1.2.3 对照品溶液的制备

分别取适量对照品西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛，精密称定，置10 mL量瓶中，以初始流动相（A-B=90∶10，V/V）配制成质量浓度约为0.4 mg/mL的对照品储备液，再用70%乙醇分别稀释成质量浓度为0.181，0.363，0.904，1.809，3.617，9.043，18.087和90.433 μg/mL的西红花苷Ⅰ系列标准溶液，质量浓度为0.197，0.394，0.984，1.968，3.935，9.838，19.675，98.377 μg/mL的西红花苷Ⅱ系列标准溶液，质量浓度为1.718，3.436，6.871，17.178，34.355，68.710和171.776 μg/mL的苦番红花素系列标准溶液，以及质量浓度为0.380，0.950，1.900，3.800，9.500和19.000 μg/mL的藏红花醛系列标准溶液，分别以液相色谱图的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 线性关系

利用UPLC对不同产地的西红花中的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛进行分析，以上色谱条件能将以上成分完全分离，理论塔板数按所测各成分色谱峰计均不低于10 000，分离度均不小于1.5，对照品和样品色谱图分别见图1和图2。其中：西红花苷Ⅰ的回归方程为Y=2.105×107X+4.623× 103，r=0.999 9，线性范围为0.181~90.433 μg/mL；西红花苷Ⅱ的回归方程为Y=2.604×107X+3.941×103，r=0.999 9，线性范围为0.197~98.377 μg/mL；苦番红花素的回归方程为Y=3.325×106X-2.921×103，r=1.000 0，线性范围为1.718~171.776 μg/mL；藏红花醛的回归方程为Y=1.224×107X-3.080×102，r=1.000 0，线性范围为0.380~19.000 μg/mL。

图1 混合对照品溶液色谱图

图2 样品液相色谱图

2.2 精密度

取编号为S1的西红花样品，按1.2.2小节进行样品预处理后上机，分别于1天内连续进样6次和连续3 d内重复进样3次，西红花苷Ⅰ的日内精密度和日间精密度分别为0.98%和1.01%，西红花苷Ⅱ的日内精密度和日间精密度分别为0.34%和1.27%，苦番红花素的日内精密度和日间精密度分别为0.92%和1.68%，藏红花醛的日内精密度和日间精密度分别为1.08%和1.77%，精密度良好。

2.3 回收率

取3份已知含量的编号为S1的西红花样品，每份20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，分别精密加入相当于样品成分量100%的各对照品溶液，按1.2.2小节进行样品预处理后上机测定，西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛的回收率分别为100.01%，100.10%，99.46%和98.00%，SRSD分别为0.14%，0.04%，0.78%和0.40%。

2.4 样品测定结果

将UPLC测得的87份样本的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛四种成分峰面积，代入标准曲线，并折算其干燥失重后，得到各样本中的各自含量，如表3所示。从表3可以看出，不同产地的西红花样本中的成分存在一定差异。浙江和上海的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ较为接近，均高于其他地区，其中浙江的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ平均含量最高，西藏和伊朗的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量较为接近，均比较低，这可能是由于浙江、江苏和上海的西红花多为大棚种植，而伊朗和西藏多为露天种植的原因；浙江产的苦番红花素的含量远高于其余产地，江苏和上海产的含量接近；藏红花醛含量江苏产的西红花含量最高，伊朗和上海的较为接近，浙江和西藏的藏红花醛含量均比较低，这可能与当地的加工工艺有关。

2.5 方差分析

分别对5个不同产地的西红花4种有效成分进行单因素方差分析，结果见表4。从表4可以看出，上海、江苏、浙江、西藏、伊朗的西红花样本中的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛这4种成分含量均存在显著性差异，P值均小于0.01。

表4 不同产地西红花有效成分差异方差分析表

2.6 主成分分析

图3是不同产地西红花样本中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛的含量进行主成分分析后前3个主成分的得分图，是校正集中的西红花样本在该三维平面上的投影。可以看出，第一主成分（PC1）的贡献率为97.58%，第二主成分（PC2）的贡献率为2.40%，第三主成分（PC3）的贡献率为0.01%，不同产地的西红花在图上有一定的分类趋势，上海的西红花样本能和其他产地样本完全分开，浙江和江苏的西红花样本也有一定的聚类趋势，但是两省样本有一定的重叠，西藏的西红花样本投影点分布比较分散，和伊朗的西红花样本有一定重叠，这是由于通过UPLC测得的西藏和伊朗的西红花样本中的有效成分含量均比较接近，投影点分布交叉较多。

2.7 模式识别

以不同产地的西红花样本的主成分得分向量作为线性判别（LDA）模型的输入，进行LDA分析。从图4（a）可以看出，当主成分因子数（Pcs）为2时，西红花产地鉴别的训练集和预测集的识别率均为最高，分别为81.03%和86.21%，预测集样本中有4个样本判别错误，其中有2个浙江的西红花样本误判为江苏，1个西藏的西红花样本误判为伊朗，1个伊朗的西红花样本误判为西藏。将不同产地的西红花样本的主成分得分向量作为K临近（KNN）模型的输入，进行KNN模型分析，当K值为1，主成分数为3时，模型的预测集识别率最高，为100%，此时训练集的识别率为96.55%。

图4 不同产地西红花样本的LDA（a）和KNN（b）模型识别率

3 结论与讨论

文章建立了一种基于UPLC法同时定量检测不同产地西红花样本中西红花苷Ⅰ（保留时间3.909 min）、西红花苷Ⅱ（保留时间4.232 min）、苦番红花素（保留时间3.235 min）、藏红花醛（保留时间11.751 min）这4种有效成分的方法，还可通过该方法同时鉴别西红花样本中是否添加柠檬黄（保留时间0.820 min）、新品红（保留时间5.118，5.702和6.551 min）、金胺O（保留时间5.210和6.222 min）、胭脂红（保留时间2.547 min）等色素，色谱图中峰形对称无干扰，分离度均大于1.5。从方差分析结果看，试验不同产地样本中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、苦番红花素、藏红花醛的含量均存在显著性差异。将UPLC测得的4种有效成分主成分分析后的得分向量作为模式识别的输入，进行LDA、KNN模式识别，结果表明KNN模型的效果更加，当主成分数为3，K值为1时，模型的训练集和预测集的识别率分别为96.55%和100%。结果表明模式识别技术结合UPLC的西红花产地鉴别是可行的。此次试验结果，发现不同产地的西红花中的有效成分存在显著性差异，但要使模型更加准确可靠，还需收集更多数量的西红花样本，此外，还需进一步研究不同产地西红花样本含量不同的原因，以便后期整体提高西红花的质量。