缺血性心脏病促血管生成治疗方法的研究进展

张 雪(综述), 柳美兰(审校)

缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的发病率及病死率均呈逐年上升趋势。IHD是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)发生的危险因素[1]。IHD的主要病理生理原因是动脉粥样硬化,血流逐渐阻塞导致心脏组织氧合不良,伴有内皮功能障碍和年龄相关性血管生成反应下降[2]。心肌缺血坏死后若不及时进行干预,将导致心室重构,进一步促进心力衰竭的发生[3]。尽管可以通过溶栓、经皮冠脉介入及冠状动脉旁路移植术等治疗方式开通闭塞和狭窄的冠状动脉,及时抢救濒临缺血坏死的心肌,防止心功能进一步下降,降低病死率[4]。但部分患者由于冠状动脉生理的因素而无法进行以上治疗。因此,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)治疗被认为是较好的治疗方式[5]。血管生成是导致新血管形成的复杂过程,可以治疗从重要器官和组织进出的病理受损或缺乏的血液流动有功能的血管系统,通过运送氧气和营养物质、清除垃圾及输送免疫细胞,对维护组织和器官正常运行至关重要[6]。新血管生成由VEGF诱导且同时需要许多细胞和蛋白质的参与。除了细胞因子、基因治疗外,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)还分泌微囊泡/外泌体,为治疗IHD提供了一种新的血管生成治疗方法[7]。本文对细胞因子、蛋白质、基因或细胞外囊泡诱导血管生成作一综述。

1 血管生成

血管生成是由缺血/缺氧诱导的内皮细胞(endothelial cells,ECs)的适应性反应。血管生成是指从现有的血管中形成新的血管,随后在体内扩张血管网络的过程[8]。通过血管生成过程产生微血管将有助于恢复缺血组织和细胞的血液和氧气供应,从而减少缺血/缺氧诱导的细胞损伤。研究显示,治疗性血管生成可加强这一过程,从而改善缺血心肌的血供[9]。治疗性血管生成涉及外源性给药,促进新生血管形成后的生长,以恢复组织的循环。在正常生理情况下,机体通过产生精准数量的促血管生成生长因子使血管生成维持稳定状态,如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)[10]。在病理生理状态下,血管生成机制可分为3个基本步骤:(1)激活;(2)ECs的增加和转移;(3)管腔结构和血管网络形成[11]。血管生成生长因子可以直接与受体结合或间接激活ECs,开启下游信号通路,促使毛细血管新生。通过周围的外周细胞、周细胞和基质细胞的稳定信号的影响重新建立稳态[12]。静脉生成是内皮祖细胞在毛细血管的位置组装,而动脉生成是通过发芽和肠套叠从现有的血管形成新的血管的一个过程[13]。研究表明,新生血管的形成不仅依赖于原有血管的发芽,而且还来自于从骨髓循环的内皮祖细胞,这些内皮祖细胞与新生血管结合并促进新生血管的形成[14]。

2 促血管生成细胞因子

促血管生成生长因子通常以纳米颗粒作为载体,通过增加局部浓度促进血管生成直接转移到靶组织,通过转录、病毒载体或DNA质粒间接促进其基因表达[6]。CVD患者的心肌细胞和ECs经常暴露于缺氧和炎症中,从而刺激缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)。HIF可通过HIF-1α途径增加各种促血管生成因子的数量,进而促进血管生成。VEGF长期以来被认为是血管生成过程中的中枢调节因子。VEGF-A通过激活酪氨酸激酶和破坏ECs黏附连接处VEGF受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)/钙黏蛋白5复合物的稳定性,提高血管的通透性[15],恢复ECs的完整性和血管功能。因此,它可以补偿缺血缺氧,保护受损的心肌,缺氧和营养缺乏会导致转录共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1,PGC-1)的激活。PGC-1是线粒体功能的主要调节因子,通过提高VEGF的表达促进血管生成。PGC-1进一步协同激活孤核受体-α(estrogen-related receptor-alpha,ERR-α)以控制独立于HIF的血管生成途径[16]。Jin等[17]发现,缺氧也能诱导ECs产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),这表明自分泌周期可以通过核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)依赖性过程介导,激活HIF,上调VEGF,促进血管生成。这在ECs中形成了TNF-α/NF-κB/HIF/VEGF信号级联。Guo等[18]发现在动脉粥样硬化斑块中,CD163+巨噬细胞通过CD163/HIF1α/VEGF-A通路参与VEGF-A的表达。膜联蛋白A1直接诱导心肌巨噬细胞向血管生成和修复表型极化,刺激心肌巨噬细胞释放大量VEGF-A,从而诱导血管生成和心脏修复[19]。对照临床试验未能证明在安全载体剂量下的治疗功效。由于VEGF在分泌后仍然紧密地定位在每个产生细胞周围的微环境中,即使在几十或几百微米的距离上,不同的生长因子浓度也不会均匀分布。因此,即使在某些区域表达过量,总VEGF剂量相当低,也足以引起异常的血管生长。如果可以实现生长因子浓度或表达水平的均匀分布,则可以控制生理血管生成[13]。bFGF也称为成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2),是FGF家族的成员。FGF主要通过RAS/MAP激酶途径与FGF受体结合和激活,从而调节细胞增殖、存活、迁移和分化等生物学功能[6]。FGF与VEGF的受体不同,FGF受体被发现在ECs和平滑肌细胞上表达,这有助于形成成熟的血管网络。FGF-2是各种细胞类型的有丝分裂原、周细胞的募集因子和细胞外基质的生产者[20-21]。HGF及其受体在心脏、肾脏和肝脏等受伤组织中高度表达,以诱导这些器官的血管生成。HGF诱导冠状动脉ECs系中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2,MMP-2)和尿激酶的表达,MMP的酶功能对于继续促进血管生成过程至关重要,HGF上调MMP以消化基底膜,从而导致细胞外基质溶解及丧失完整性[20-22]。虽然研究发现,生长因子具有显著的血管生成特性,但由于其半衰期短且体内生物稳定性差,其疗效较差。

3 蛋白质/基因治疗

新血管生成是由VEGF诱导的,同时需要许多细胞和蛋白质的参与[23]。利用蛋白质或基因在细胞水平上刺激血管生成是一种成熟的治疗方法。蛋白质治疗可通过静脉、动脉内、肌肉内或心肌内注射重组血管肽进行。基因治疗涉及外源核酸转移到靶细胞,以刺激所选基因的持续治疗表达。蛋白质的局限性是外源蛋白在靶组织中的半衰期较短[24],降低了治疗效益,临床试验采用基因治疗延长蛋白的表达时间。基因转移可能是病毒性的,也可能是非病毒性的。其一直以来使用腺病毒载体作为载体,已被证明可以提高DNA转移的效率[2]。经皮冠状动脉成形术中Ad-VEGF165与质粒DNA-VEGF165的心肌内注射。Ad-VEGF165可使心肌灌注程度提高[25]。有研究使用同时编码VEGF和PDGF的组合质粒,发现其对ECs迁移和血管形成具有诱导作用[26]。因此,采用这种配对方法,同时给予FGF-2和PDGF-β可以显著改善大鼠和兔缺血后肢模型的侧支网络形成和血液灌注[27]。同时使用2种或2种以上的蛋白质、基因,或蛋白质和基因的结合,是一种更有效、更稳定的促进血管生长的方法。第一代心血管VEGF临床试验中,VEGF蛋白递送也被用于治疗糖尿病患者的慢性足部溃疡,但疗效有限。限制VEGF功效的主要问题是其治疗剂量,例如通过基因递送,已被证明具有较大难度,较低剂量的基因治疗载体无效,较高剂量的基因治疗载体则会迅速引起异常血管生长[28-29]。

4 细胞治疗

细胞治疗是通过控制心脏缺血时的自分泌和旁分泌机制来刺激和调节治疗性血管生成的生物途径的最佳选择,骨髓细胞(bone marrow-derived cells,BMCs)受到关注[30]。目前的干细胞研究集中在通过改善细胞归巢、结合细胞疗法和使用驻留细胞群来优化细胞治疗[31]。研究显示,慢性IHD患者使用BMCs治疗后心脏功能得到改善,且具有安全性[32]。有研究表明,在急性心肌梗死和慢性缺血性心肌病动物模型中,MSCs移植后整体体积减小了约7%,心功能改善了约11%[33]。Karantalis等[34]研究也证实,冠状动脉旁路移植术患者心肌内注射MSCs可使注射部位的血管新生,瘢痕减少,改善组织灌注及区域功能。MSCs的心脏保护作用得益于其促进新生血管形成的能力,原因可能为:(1)MSCs分泌可溶性旁分泌因子,促进血管生成;(2)MSCs能够分化成形成血管基础的ECs、周细胞和平滑肌细胞。这些过程都参与了MSCs对IHD疾病的作用机制,促进MSCs血管生成主要是通过分泌CXCL1、CXCL5、CXCL6、CXCL8、HGF等细胞因子[35-36]。这种类型的治疗性血管生成还存在一些问题。移植的细胞可能在组织/器官(如心脏)中具有不可预测和不可控的行为,心肌内直接注射是将细胞或副产物直接注射到损伤组织中,通常需要开胸手术,可能会引起术后疼痛和增加患者预后不良的风险。因此,干细胞试验效率降低和移植后生存率低[37]。

5 外泌体

BMCs可迅速从骨髓中动员并重新招募到缺血心脏,促进血管生成和心脏修复。近年来的研究表明,MSCs的作用主要是通过分泌旁分泌因子,包括抗凋亡因子、促血管生成因子和外泌体,而不是通过分化为心肌细胞[38]。对旁分泌信号的高度关注,促使人们更多地关注细胞外囊泡,而不仅是细胞本身。这些囊泡中最受关注的是外泌体,外泌体被广泛地认为是无细胞治疗的候选者[39]。外泌体是一种纳米大小的颗粒,从质膜释放为多泡体。它被认为是细胞之间通信、免疫调节、增殖、细胞衰老和分化的重要媒介,通过将各种生物活性物质如mRNA、microRNA、蛋白质和脂质从一个细胞转移到另一个细胞[40]。MSCs衍生的外泌体对促进血管生成、抗细胞凋亡及抗炎方面发挥心脏保护作用。越来越多的证据表明,HIF-1α增强的血管生成在介导心脏保护中起着关键作用,Exo-HIF-1α对缺血心脏的促血管生成和保护作用是通过VEGF和PDGF介导的。此外,缺氧损伤的ECs的血管生成、增殖和迁移也被Exo-HIF-1α所改善[41]。Huang等[40]研究发现,过表达miR-126通过激活PI3K/Akt和MAPK/ERK通路以及释放VEGF和bFGF因子,促进MSCs向ECs的分化。在缺氧组织中,SDF-1和CXCR-4也是细胞迁移的重要因素。缺血的心肌和血管组织分泌SDF-1来吸引CXCR-4表达的细胞。Shi等[35]发现SDF-1/CXCR-4可能通过激活PI3K/Akt信号通路介导BMCs向心肌梗死的迁移。因此,MSCs分泌的旁分泌因子在新生血管形成过程中发挥重要作用。

6 结语

IHD是严重威胁人类健康的疾病,介入治疗和药物治疗在心血管治疗方面取得了巨大突破。CVD患者逐年增多,其发病率和病死率均较高。为了减少IHD造成的危害,新的医学疗法需要更多的实验研究来证明。促血管生成是治疗IHD的一种较有前景的方法。但是在基因治疗方面,血管生成基因治疗诱导的增量毛细血管水平的血管化,本身可能不足以改善大肌区血管重建术,挽救缺血心肌。腺相关病毒的转染也可能会诱导免疫和炎症反应,从而损害缺血心肌的功能。另外,血液和氧气的短缺也会影响注射的干细胞。尤其是干细胞移植后生存率低、移植途径等都限制了MSCs治疗发展。近年来,研究探讨了多种新策略来增强基于干细胞的疗法,细胞来源的外泌体也降低了使用细胞疗法的限制。在缺氧、酸中毒和氧化应激反应中,微囊泡的释放增加,增强MSCs的旁分泌作用。另外,血管生成与动脉粥样硬化的冲突是IHD促血管生成治疗中存在的问题。新生血管有利于缺血心肌,而脆弱和出血的新生血管也会导致斑块的不稳定、破裂和出血。未来需要更多的研究来解决这些问题。