补肾活血法调控卵巢颗粒细胞凋亡防治卵巢早衰的机制研究进展

郭海霞,叶长青,金梦媛,罗洪斌

湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指患者在40岁以前便出现了因卵巢内卵泡耗竭等原因引起的卵巢功能衰竭疾病,该类女性的月经初潮年龄或正常或延迟,血清促卵泡激素(FSH)水平高、雌激素水平低,临床症状主要有月经量少、闭经、不孕等,有的患者还会伴有潮热、盗汗等围绝经期综合征表现[1]。POF属于女性内分泌疾病,是引起不孕的主要原因之一,其发病的因素多,主要有免疫功能紊乱、遗传、放射治疗、化学治疗等[2]。研究发现[3]POF发病率约为1%,且逐年增加,30岁以前发病率为0.1%,发病年龄呈年轻化趋势。目前,西医主要采用激素替代疗法治疗,可保护中枢神经,减少AD的发生风险[4],但长时间使用激素容易增加患子宫内膜癌、乳腺癌等疾病的风险;同时许多POF患者无法正常受孕,往往会借助辅助生殖技术助孕,但由于不易获得质量较高的卵子进行体外受精,因此很多患者最终很难成功妊娠。现代研究表明[5]中医可改善月经、排卵及围绝经期症状,如潮热、盗汗、失眠、焦虑和骨质疏松症等,对多种妇科疾病如多囊卵巢综合征等都有良好疗效。中医认为,POF虚是根本,根据“因虚致瘀”理论,血瘀是其关键病机,临床中运用补肾活血法治疗POF疗效明显,研究表明[6]补肾活血方可通过降低FSH和T淋巴细胞比例(CD4+CD25+/CD4+)水平,提高抑制素(Inh)和雌二醇(E2)水平,减少细胞凋亡,从而使POF大鼠的卵巢健康状况有所改善,即可调节性激素水平、抑制细胞凋亡,从而对卵巢的储备功能起到保护作用;刘慧萍等[7]发现补肾活血方可抑制Fas、FasL的mRNA表达和提高E2,降低黄体生成素(LH)、FSH水平,改善卵泡颗粒细胞的凋亡最终达到治疗作用。

补肾活血法主要是通过调控下丘脑-垂体-卵巢轴的神经内分泌功能、改善卵巢血流动力学与卵巢微循环、抑制卵巢颗粒细胞凋亡等发挥对卵巢早衰的调节作用[8],其中抑制卵巢颗粒细胞凋亡是其主要的作用机制之一。本文将就补肾活血法通过调控卵巢颗粒细胞凋亡防治卵巢早衰的作用机制进行综述,以期为临床及实验研究提供相关参考依据。

1 POF与颗粒细胞凋亡的关系

细胞凋亡是一种主动的、程序性的、基因控制的细胞自主有序的死亡,它在卵泡发育的各个阶段都有参与,因此,在卵巢疾病的发生发展中起到关键作用。卵泡的组成部分主要有卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞,卵巢和卵泡微环境的自身稳态维持着卵母细胞的成熟,而卵母细胞发挥指导和促进颗粒细胞增殖和分化的功能,颗粒细胞提供卵母细胞生长发育所需的营养物质,二者在卵泡的发育、成熟和排卵的整个过程中都存在着紧密的联系,其中,颗粒细胞的状态影响着卵母细胞的质量和胚胎发育潜能。一般情况下,卵泡闭锁是卵巢生理功能的重要部分,可清除不正常的组织,一旦颗粒细胞的凋亡机制发生紊乱,大量卵泡闭锁发生在卵母细胞还未成熟时,并且其闭锁速度快于生理代谢的速度时,卵巢储备将会过早的耗尽[9],所以在一定条件下,不可避免地加快卵泡闭锁,从而引起POF发生。

过度或紊乱的颗粒细胞凋亡是卵母细胞发育能力受损的标志,影响了卵母细胞和颗粒细胞在卵泡发育中的紧密联系,抑制了卵母细胞的生长,导致卵泡闭锁加速,从而影响卵巢功能[10],因此,POF的发生与卵泡颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁密切相关。卵泡颗粒细胞凋亡导致卵泡闭锁,进而导致女性生殖能力的衰退[11]。HUANG等[12]发现对发生卵泡颗粒细胞紊乱的POF小鼠进行干预后,可逆转相关指标并纠正相关蛋白的表达,由此可见,在POF的发展过程中,卵泡颗粒细胞发挥了关键性作用。

2 补肾活血法与颗粒细胞凋亡的关系

细胞凋亡是机体重要的自我稳态机制,是由促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和凋亡调控因子等在相应的信号通路的作用下共同参与的过程[13],与颗粒细胞凋亡相关的蛋白有Bcl-2蛋白家族、Caspase-3、FOXO3、Myc和P53等[14]。研究显示[15]补肾活血中药具有抑制颗粒细胞凋亡的作用。补肾活血中药能够抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C、caspase-3的激活,使颗粒细胞的凋亡减少,避免了卵泡的过度闭锁,从而保护了卵巢的储备功能;由当归、熟地黄等组成的补肾活血方能够使POF小鼠卵巢中Bcl-2/Bax的比值增大,caspase-3 mRNA的表达量减少,从而使卵巢颗粒细胞的凋亡受到抑制,有效减少卵泡闭锁,进而起到改善卵巢储备功能的作用[16];益肾调经方可能是通过增加抗凋亡因子Bcl-2的表达,使促凋亡因子caspase-3、Bax的表达下调,从而使大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡受到抑制,达到改善卵巢功能的作用[17]。

3 颗粒细胞凋亡相关蛋白

3.1Bcl-2蛋白家族Bcl-2家族蛋白是调控细胞凋亡的重要蛋白。Bcl-2蛋白可有效抑制细胞凋亡,利于卵泡的生长发育;Bax则相反,它可促进细胞的凋亡,从而加快卵泡闭锁的速度,二者共同调控着卵巢卵泡生长发育的各个阶段。研究显示亡[18]Bax蛋白在卵子细胞死亡过程中起关键性作用,它可运用小分子干扰RNA(siRNA)干扰Bax的表达,从而达到抑制颗粒细胞凋亡的作用。bcl-2蛋白和bax蛋白形成同二聚体或异二聚体表达,调控颗粒细胞的凋。研究表明亡[19]大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡可由颗粒细胞中自噬体的积累使得Bcl-2的表达减少而诱导,并加速卵泡闭锁从而发生POF。廖风娇[20]研究表明新加归肾丸具有改善雷公藤多苷导致的大鼠卵巢损伤的作用,可通过调节Bax、Bcl-2 mRNA的蛋白表达量来达到促进颗粒细胞增殖的作用,进而使卵巢储备功能得到改善。

3.2Caspase-3Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡过程中具有重要作用,caspase-3又是其中最重要的细胞凋亡效应分子,它可通过多种途径诱导细胞凋亡的发生。研究表明[21]Caspase蛋白酶可通过激活Caspase-3等引起Caspases的级联反应,最终导致细胞凋亡,所以,细胞凋亡的相关情况可通过Caspase-3的表达反应出来,因此,caspase基因很可能是诱导颗粒细胞发生凋亡的主要机制之一。张丽娜等[21]研究发现补肾活血方能抑制Bax及Caspase-3蛋白的表达,治疗雷公藤多苷诱发的卵巢颗粒细胞凋亡引起的卵巢早衰。

3.3FOXO3FOXO3是FOXO的转录因子,颗粒细胞的凋亡可通过上调FOXO3的表达诱发,进而诱导卵泡发生闭锁。FOXO3a转录因子为FOXO蛋白家族的成员之一,调控细胞的增殖、生长、分化、调亡及衰老等重要的生命过程。另外,FOXO3a转录因子作为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路下游的重要靶蛋白之一,具有调节细胞周期阻滞蛋白P27kip1和促凋亡蛋白Bim的功能,从而对细胞周期及细胞凋亡进行调控。研究显示[22]二仙汤具有降低FOXO3a表达的作用,从而使P27kip1及Bim的表达下调,进而抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,具有保护因顺铂损伤的卵巢颗粒细胞的作用。

3.4Myc蛋白Myc是核蛋白类基因中的一种,是较早发现的癌基因,C-myc、N-myc和L-myc是目前发现的3种,Myc可影响细胞的周期、分化,调控细胞的增殖和凋亡。研究显示,Myc蛋白可能通过促进颗粒细胞的凋亡,从而使卵泡膜细胞发生凋亡。随着卵泡发育和功能的完善Myc基因的表达会发生相应变化,在卵泡发育的原始阶段呈强阳性,随着卵泡的发育,强阳性会逐渐减弱,在卵泡闭锁时,可能只在卵泡膜细胞中可检测到Myc蛋白。王海丹等[23]研究表明补肾健脾方具有治疗POF的作用,可能是通过提高E2水平,激活雌激素受体(ER),从而促进c-Myc的表达,调节端粒酶逆转录酶(TERT)的表达来促进卵巢颗粒细胞的增殖。

3.5P53p53是一种重要的促凋亡基因,它可通过抑制细胞的转化生长,调节细胞的分裂过程,p53的激活还可调节其它凋亡因子发挥作用。研究表明[24]p53可能通过抑制颗粒细胞中由TGF-β1诱导的有关miRNA的表达来调控卵巢颗粒细胞的生长、发展和凋亡。作为DNA损伤凋亡通路中的关键调控因子,P53的一个同系物TAp63可与磷酸化的c-Abl(一种原癌基因)发生相互作用,然后级联激活促凋亡相关分子Bax和Bak,使颗粒细胞凋亡发生级联反应。常卓等[25]研究发现,运用补肾活血方对不明原因复发性流产(URSA)小鼠的蜕膜化过程进行调节,可发现蜕膜化中后期的p53、p21表达显著降低。

4 颗粒细胞凋亡相关信号通路

4.1PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K/Akt信号通路对卵巢颗粒细胞的凋亡起到调控作用,该通路主要参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程。PI3K/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路广泛存在于卵母细胞和颗粒细胞中,可维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡。经研究发现[10]调节颗粒细胞的增殖和分化有PI3K/Akt信号通路中的许多分子的参与。研究表明[26]补肾活血方可对PI3K/Akt/mTOR信号通路进行激活,进而使caspase3的表达下调,卵泡凋亡减少,最终改善卵巢储备功能。新加归肾丸通过激活mTOR信号通路,从而提高细胞周期蛋白D2的表达,加速卵巢颗粒细胞周期的进程,从而实现颗粒细胞的增殖达到改善卵泡发育的作用[27]。对PI3K/AKT/mTOR通路进行激活后,还可使下游自噬效应分子Beclin 1及微管相关蛋白2轻链3(LC3-II)的表达减少并降低p62的消耗,从而修复雷公藤甲素诱导的大鼠卵巢颗粒细胞的自噬损伤,进而改善卵巢储备功能[28]。左归丸通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路的蛋白表达,使Bcl-2得到上调,Bax的表达下调,抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,使残存卵泡得到发育,进而保护卵巢功能[29]。补肾活血方可调节卵巢组织中的颗粒细胞,上调小鼠PI3K、AKT及MTOR的蛋白表达量,使E2升高,FSH和LH降低,从而达到促排卵,减少卵泡闭锁的作用,最终使卵巢环境和内分泌功能得到改善[30]。

4.2NF-κB信号通路核转录因子-кB(NF-кB)可参与激活多种细胞进程中的基因转录、细胞凋亡和免疫应答的信号传导。NF-κB在次级卵泡到窦卵泡的过渡过程中被激活,可通过卵泡刺激素受体(FSH receptor,FSHR)及其相应的靶分子起到抑制颗粒细胞凋亡的作用,从而促进细胞的增殖和分化,与此同时,被激活的Bcl-2在细胞质内与NF-κB形成Bcl-2-NF-κB复合物也具有抑制颗粒细胞凋亡的作用。POF的发生与NF-κB失活关系密切,如果NF-κB在卵巢卵母细胞和颗粒细胞发育过程中的信号转导减弱,卵泡发育将会出现异常,导致卵泡闭锁,最终引发POF。研究发现[31]下调转基因小鼠中的NF-κB,其窦卵泡数量减少了,E2和抗缪勒氏管激素(AMH)的水平也降低了,认为NF-κB可能是通过葡萄糖调节蛋白78(GRP78)介导的内质网应激来调节卵泡刺激素受体的表达,从而使颗粒细胞发生增殖,促使卵泡的发育成熟。袁苑[32]研究发现补肾促卵方可使骨形态发生蛋白7(BMP-7)的表达水平上调,caspase-3的表达下调,从而抑制雷公藤多苷诱导的离体小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡,进而恢复其卵巢功能,其可能是通过细胞信号转导分子(Smad)和NF-κB两条信号通路来介导对BMP-7、caspase-3的调控。

4.3TGF-β/Smads信号通路转化生长因子-β(TGF-β)/Smads通路对颗粒细胞的增殖、分化具有重要的调控作用,参与了卵泡的生长发育,卵巢颗粒细胞可分泌TGF-β1,并且颗粒细胞表面含有TGF-β受体,它对窦前卵泡生长、颗粒细胞增生与分化具有促进作用。研究显示[33]补肾活血方对免疫性POF小鼠TGF-β1/Smads信号通路的传导具有明显的促进作用,从而利于颗粒细胞的增殖和分化,减少了颗粒细胞的凋亡,进而调控了卵泡的发育,改善了卵巢的功能。卵巢颗粒细胞可分泌一种肽类物质激活素A(Act A),补肾活血方可促进Act A的分泌,使激活素ⅡA型受体、Smad2、Smad3的表达上调,然后通过Act A/Smads信号转导通路,推动卵巢颗粒细胞的增殖和分化,从而提高芳香化酶的表达和活性,使卵巢颗粒细胞更好的发挥调节卵泡发育的功能,促使卵巢局部微环境得到很好的改善[34]。

4.4Nrf2/ARE信号通路Nrf2/ARE信号通路主要由核因子NF-E2相关因子(Nrf 2)、Bach1和抗氧化反应元件(Are)等组成,为最重要的内源性抗氧化应激通路[19],具有维持细胞稳态、抑制细胞凋亡等方面的重要作用。研究表明[15]补肾促卵方通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)过表达,从而促进Nrf2核易位,使下游抗氧化酶活性得到激活,可对抗雷公藤多苷诱导的DOR小鼠的卵巢氧化应激损伤,从而避免卵泡颗粒细胞过度凋亡,防止卵泡发生异常闭锁。

近年来,POF的发病率不断上升,中医药疗法在POF防治方面的作用越来越被广大患者所接受。POF在中医典籍上没有记载,但从其症状来看,常与“血枯”“经水早断”“不孕”等有关。古代医家对该类疾病的病因病机虽然各有看法,但都认为肾虚是主要致病因素,《素问·上古天真论》云:“女子……,七七任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也。”《妇人归·经脉之本》曰:“天癸者,言后天之阴气,阴气足而月事通。”《传忠录·阴阳篇》曰:“元阴者,即无形之水,以长以立,天癸是也,强弱系之,故亦曰元精。”《傅青主女科》云:“经水出诸肾”,都认为肾藏精,主生殖,肾精的盛衰影响着天癸的至竭、冲任二脉的盛衰以及月事的行止,肾虚精亏可致天癸不能按时正常充盈而出现过早的耗竭,最终导致POF。女子以血为本,以气为用,气血调和,则脏腑功能正常,肾虚精亏则瘀血内生,可致不孕,《陈素庵妇科补解》曰:“妇人诸疾,多由经水不调。调经,然后可以孕子,然后可以却疾。”《妇科玉尺》曰:“养血之法,莫先于调经。盖经不调则血气乖争,不能成孕。”《女科要旨》亦云:“妇人无子,皆由经水不调……种子之法,即在于调经之中。”一旦气血失调,则极易导致瘀血阻滞胞中,不能益肾,另外瘀血不祛,新血不生,则经血失源,从而引起脏腑功能失常,而女子经、孕、胎、产、乳最易伤精耗血,故肾虚血瘀是导致POF的主要病机,临床上治疗POF多以补肾活血法为原则遣方用药。

现代药理研究发现[35]补肾活血中药的化学成分丰富多样,主要有黄酮、甾体、糖类等成分,主要发挥抑制血小板聚集及抗血栓、抗炎等作用。依据补肾活血法组成的中药复方可通过多种信号通路和相关蛋白起到抑制卵巢颗粒细胞凋亡的作用,从而防治POF。但补肾活血复方药味较多,药物之间的相互作用是否会产生新的物质因子作用于疾病,还有待进行深入挖掘研究;对补肾活血中药的禁忌症缺乏报道,后续可增加相关研究数据使其作用机制更加完善。