炎症反应在颅内动脉瘤进展和破裂中的作用

李悦 吉航 刘翼

颅内动脉瘤(IA)是一种常见的血管疾病,人群患病率为3～8%。部分IA可以逐渐发展直至破裂出血,形成自发性蛛网膜下腔出血(SAH)。尽管破裂的总体概率不高,IA破裂引起的SAH可以造成约25%病 人的院前死亡,以及总体约50%的病 人死亡和神经功能废损[1]。相对于其他形式的脑卒中,IA的病 人群体更年轻(中位患病年龄约55岁),因而导致更沉重的疾病负担和更高的伤残调整生命年。目前,IA的临床治疗手段包括血管内介入治疗和开放手术,可以有效的阻断高风险IA的破裂和破裂IA的再出血。然而,对于占比更高的暂时“稳定”的IA病 人,目前只能建议保守治疗和定期复查,暂无有针对性、经济,且风险小的临床干预措施。这使得病 人始终处于IA意外破裂的风险中。因此,深入探索IA进展和破裂的机制有助于开发和制定针对暂时稳定IA的治疗和临床管理策略。

炎症反应在IA进展和破裂中发挥重要作用。同时,炎症反应与病人遗传易感性、表观遗传特征、环境因素等的广泛关联提示炎症是多种IA潜在病因作用的综合反映[2]。因此,在缺乏整合研究手段的当下,探索炎症反应的特征及其与IA分子病理改变、临床表型的关联有助于对未破裂IA病人进行风险分层,加深对疾病机制的理解和促进开发有效的分子靶点。本文将总结炎症在IA中的重要研究进展,包括血管对血流变化的响应及炎症在其中的作用,关键炎症细胞和介质对IA瘤壁完整性的影响等。尽管以往认为IA进展和破裂是不同的病理过程,近期的研究提示二者的危险因素十分相似[3],这意味着IA进展和破裂的局部病理学改变可能是同源的、发展的关系。因此本文不对炎症反应之于IA进展和破裂的作用加以区分。

一、血流动力学与血管壁的适应性改变

将血液在血管中的流动简化为牛顿流体的运动,血管壁承受切向的壁面剪切应力(WSS)和法向的周向应力。二者与血液流速、膨胀压、血管直径、血管壁厚度和血液黏稠度有关。生理水平血液流速和血压的变化在一个区间内,则WSS和周向应力是血管直径和厚度的函数,即壁面剪切应力受到管径的调节,而膨胀压则与血管壁厚度相关[4]。血流和血压适应于生理条件的改变处于波动中,通过调节血管直径和管壁厚度,WSS和周向应力也被维持在一个范围内。在IA中,WSS是一个备受关注的血流动力学参数。有假说提出,低WSS伴随高震荡剪切指数将促进炎症反应,从而导致巨大、粥样硬化性IA的形成;相反,高WSS和正WSS梯度可以通过破坏壁细胞和血管外基质诱导较小的IA破裂[5]。

血管适应WSS的变化主要依赖于内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(vSMC)功能状态的调整。EC和vSMC是颅内血管的主要细胞成分,在调节血管舒缩活动以及血管结构适应性重塑方面发挥重要作用。EC直接感知血流的改变,通过产生NO/ET-1对WSS的改变做出应答。WSS持续异常可以引起血管壁的重塑。这种重塑作用依赖于EC的NF-κB转录激活和下游炎症基因的表达。EC功能的改变同时诱导vSMC状态的变化。vSMC是主要的壁细胞,具有收缩功能和调整细胞外基质成分的作用。vSMC需要对来自内皮细胞的NO/ET-1信号作出应答,通过舒缩作用即时调节管径以便维持适当的WSS。vSMC还可以感知血压引起的血管壁拉应力,进而调控胶原的产生和交联。在WSS持续异常的状态下,vSMC的表型转化和异常增殖介导了肌内膜增厚和血管壁重塑。

二、血流动力学紊乱介导的EC功能受损启动炎症反应

EC功能紊乱或缺失是血流动力学诱导IA形成的一个关键事件。EC表面的压力传感器包括离子通道、整合素、细胞黏附分子和G蛋白偶联受体等。在层流的条件下,WSS通过这些压力传感器同时激活抑制有丝分裂的AMPK和促进增殖的Akt,调节mTOR信号的平衡,进而阻滞EC细胞周期进程。一旦WSS降低,EC发生形态学改变甚至凋亡,并产生大量血管活性和炎症介质。IL-1β和TNF介导的EC NF-κB的激活是炎症反应启动的关键[6]。NF-κB诱导环氧化酶(COX)表达上调,在局部产生大量前列腺素,后者又可通过结合前列腺素E2受体维持NF-κB的活化状态,形成正反馈。NF-κB诱导的VCAM-1、CAM-1、MCP-1,以及低WSS状态将促进炎症细胞的黏附和浸润。EC形态学的改变导致血管通透性增加也促进炎症细胞的局部浸润。EC的形态学的改变与低WSS诱导肌动蛋白丝排列异常有关,并将在PKC和p53信号通路的作用下发生凋亡。

局部EC的缺失导致血小板(PLT)的迅速聚集和激活,形成局部血栓,进而募集大量炎症细胞。外周血中性粒细胞极易受到活化PLT的募集。PLT表达的血小板受体GPIbα启动中性粒细胞的渗出。在PLT来源的P-selectin/CD40L与中性粒细胞受体PSGL-1/CD40的作用下,PLT和中性粒细胞形成血小板-中性粒细胞复合物,相互激活进而释放更多的炎症介质。最近的研究显示,PLT可以调控巨噬细胞的功能,并与心血管疾病的进展有关。在血小板-巨噬细胞复合物中,活化PLT诱导巨噬细胞SOCS3表达上调和SOCS1/SOCS3比例下降,从而促进巨噬细胞的炎症表型和IL-6/IL-1β/TNF-α等表达上调[7]。因此,IA附壁血栓的形成极大地加速了IA的病理进程。

三、炎症反应介导的平滑肌细胞表型转换

vSMC的病理性表型转换是IA形成和发展的关键事件[8]。除血管拉应力外,生长因子/生长抑制因子、转录因子、炎症因子、细胞-细胞相互作用,以及细胞外基质的改变均可调控vSMC的表型。CD137L-CD137可以结合NFATc1蛋白,进而抑制收缩蛋白的表达。类似的,补体C3也能够抑制收缩蛋白的表达,促进vSMC转换为合成型,miR-145则通过抑制C3促进vSMC转化为收缩型。此外,NLRP3炎症小体、IL-1β、巨噬细胞来源的外泌体均能诱导vSMC去分化。除炎症因子外,代谢因素(如乳酸、同型半胱氨酸、氧化低密度脂蛋白)、生长因子(如PDGF-BB、TGF-β、SMAD 2/3)、转录因子(如KLF4、RUNX2、SOX9)、非编码RNA(如miR-182-3p、miR-206、miR-542-3p)以及整合素家族均参与vSMC表型的调控。既往认为,vSMC具有收缩型和合成/增殖型两种表型。近期的研究发现,vSMC具有表型多样性[9]。合成型vSMC高表达骨调素OPN、MMP-9、波形蛋白VIM等;成骨型vSMC高表达骨性标志物如 OC、Col1α1、II/X型胶原等,并参与血管钙化;巨噬细胞样vSMC表达CD68和α-SMA并具有吞噬功能;间充质样vSMC高表达干细胞标志物SCA1,并可向收缩型vSMC分化;成纤维细胞样vSMC表达成纤维细胞标志物如DCN、BGN、LUM,在粥样硬化斑块中常见。尽管如此,IA中vSMC的表型及其与IA不同类型、进展和破裂的关联仍需探索。

四、IA壁中的单核/巨噬细胞是炎症反应的枢纽

大量研究表明,单核/巨噬细胞(Mono/Maco)在IA进展和破裂中发挥关键的作用[2]。Mono/Macro和淋巴细胞的浸润可能发生在IA形成的早期。由于取样的限制,我们难以得知这些早期浸润的免疫细胞的功能,以及它们如何影响IA的进程。通过免疫组化和影像学的研究,人们发现,Mono/Macro比例的升高是IA破裂的独立危险因素。同时,小规模的临床试验显示,每周大于三次服用阿司匹林可以减轻IA壁的炎症反应,可能与降低Mono/Macro的浸润有关。基于巨噬细胞M1/M2型的理论,促炎型M1巨噬细胞和抗炎型M2巨噬细胞比例失衡对于IA壁细胞的损失和细胞外基质的降解是重要的,因为促炎型M1巨噬细胞可以产生大量的TNF、IL-1β以及MMPs。我们发现,Mono/Macro是IA壁中含量最多的免疫细胞类型之一。在募集免疫细胞和与其他细胞相互作用方面,巨噬细胞(Macro)是最活跃的。Macro表达大量的趋化因子和TNF。趋化因子通过结合相应受体,定向作用于中性粒细胞、肥大细胞等;TNF则作用于局部几乎所有的细胞,其激活免疫细胞的作用不言而喻。在募集炎症细胞方面,抗炎型M2巨噬细胞与M1型巨噬细胞同样活跃,这意味着抗炎的M2细胞也有能力募集大量免疫细胞。不同之处在于,M2巨噬细胞表达的LGALS9高于TNF。LGALS9编码的半乳糖凝集素9(Galectin-9)通过结合HIVCR2可以诱导Th1细胞死亡,从而拮抗M1型巨噬细胞。同时,Galectin-9也可以促进局部IL-1β水平的升高,后者是促进IA进展的关键因素。另外,Galectin-9也诱导ERK1/2的磷酸化促进IL-6/IL-8/IL-12以及多种趋化因子的释放。因此,IA局部的M2巨噬细胞并非只发挥平息炎症反应的作用,而仅仅是拮抗Th1型炎症反应。这些结果表明,Mono/Macro是IA局部炎症反应的枢纽,发挥募集免疫细胞和调控功能的作用。

五、中性粒细胞是炎症反应破坏IA壁的效应器

既往的研究并不重视中性粒细胞在IA中的局部浸润及其影响。然而,近期的研究发现,中性粒细胞产生的中性粒细胞诱捕网(NETs)可以加速IA破裂[10]。NETs是中性粒细胞死亡时释放的DNA、组蛋白、抗菌肽等交织形成的网状结构的物质,具有捕获和杀死细胞外病原体的功能。在小鼠IA模型中,研究人员观察到了NETs的存在,以及NETs与IA形成和破裂的强相关性。全局或局部敲除肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)可以抑制NETs的水平。使用Cl-amidine也可以有效降低NETs水平,并伴随ICAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β等表达的降低。此外,一些研究提示中性粒细胞高表达MPO与IA壁损伤的关联。我们发现,中性粒细胞受到以Mono/Macro为主的多种细胞的募集,但与其他免疫细胞、血管细胞的相互作用是稀疏的,因此认为中性粒细胞是炎症反应的效应器。然而,基于免疫组化方法检测IA局部中性粒细胞浸润水平与单细胞测序技术有较大的偏差。可能由于基于免疫组化的研究观察到的中性粒细胞较少,导致研究人员对中性粒细胞的关注不足。我们推测下列因素导致这种情况的发生:(1)样本的偏倚。免疫组织化学对样本小大的要求较低,而单细胞转录组测序需要相对大的组织。这使得免疫组化可以用于研究较小的IA。其中,部分IA处于相对早期的阶段,免疫细胞浸润稀疏。相对而言,较大的IA更可能经历了较长的病程,炎症反应存在且处于平衡状态。(2)技术的偏倚。免疫组化与单细胞转录组测序对中性粒细胞的捕获效率差异的系统研究尚未见报道,但单细胞转录组是捕获细胞更敏感的方式。在结果的稳健性方面,单细胞转录组测序可以同时比较多种标志基因的表达,更有希望获得稳健的结果。近期有研究显示,尽管寿命短暂,中性粒细胞在外周血和组织浸润后均存在显著的功能异质性[11]。这意味着IA局部的中性粒细胞可能不全是破坏性的,进一步鉴定中性粒细胞功能亚群及其对IA的病理意义是未来研究的方向。

六、展望

随着人口老龄化的加重,IA的检出率日渐增高。炎症反应在IA的研究中受到关注的原因在于大多数病 人可能处于疾病“稳定”的阶段,而目前缺乏相应的临床管理共识和恰当的治疗方法。炎症反应局部的多种细胞、介质与IA壁损害、进展和破裂的关联已经逐步得到鉴定。然而,目前尚无靶向炎症反应的药物治疗可以有效阻断IA的进展。我们认为,这可能与以下因素有关:(1)IA发病、进展和破裂的复杂性。IA的发生依赖于遗传易感性、表观遗传、环境等诸多因素的相互作用。然而,目前缺乏有效的手段整合研究这些不同水平的特征。炎症反应是多种因素作用的综合反映,但炎症与其他IA诱发因素的关联尚未被充分探索。(2)炎症反应网络具有复杂性,目前研究的通量限制了我们对细胞、炎症介质相互作用的探讨。近年来,常规转录组、单细胞/空间转录组测序,以及包括蛋白质组、代谢组学等其他组学技术逐渐被应用于IA的研究,极大地扩展了我们对疾病的认识。但是在探讨相互作用方面,这些组学手段非常依赖于统计推断,也存在相当程度的假阳性率。因此,探索高效的分子-分子、细胞-细胞、血流动力学-细胞、基因-力学相互作用研究技术有助于解码复杂的炎症反应网络,以及理解不同水平的因素在IA进展和破裂中的作用。