河南省禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性

谭欢欢, 姜 佳, 刘金亮, 张 渊, 郭旭昊,魏江桥, 钱 乐, 徐建强, 刘圣明

(河南科技大学 园艺与植物保护学院 植物保护系，河南 洛阳 471023)

由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum引起的小麦赤霉病 (Fusariumhead blight，FHB) 是世界流行性病害，近年来已成为威胁我国小麦生产的最主要病害之一[1-2]。该病不仅严重影响小麦的产量，而且降低小麦的品质[3-4]，其产生的多种衍生真菌毒素及次生代谢物质，严重威胁着人类和动物的健康[5]。小麦赤霉病不仅在我国长江中、下游地区普遍发生，而且近几年来在黄河及其附近流域也常有发生，并有逐渐向北扩展蔓延的趋势[2,6-7]。由于生产上缺乏高抗或免疫赤霉病的小麦品种[8]，化学防治仍是防控小麦赤霉病的重要措施[9-10]。自20 世纪70 年代以来，我国一直使用多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂来防治小麦赤霉病。然而，由于其被长期大量使用且作用靶标单一，病原真菌极易对其产生抗性，从而导致药剂防效下降或丧失[5]。

丙硫菌唑 (prothioconazole) 是拜耳公司研发的一种新型三唑硫酮类杀菌剂，2004 年在德国上市，不仅具有良好的内吸性、优异的保护性、治疗性和铲除性能，且持效期长，其作用机制为抑制真菌甾醇生物合成中C-14 的脱甲基化，进而影响真菌细胞膜的功能[11]。丙硫菌唑具有广谱的杀菌活性，对许多真菌病害都具有良好的杀菌效果[12]，尤其是对小麦赤霉病的防治效果显著且增产明显[11,13]。自2019 年1 月丙硫菌唑在我国获批登记用于小麦赤霉病等的防治以来，尚未发现禾谷镰孢菌对其产生抗性的报道，且先前的研究发现禾谷镰孢菌对其有较低的抗药性风险[14]。鉴于此，本研究采用菌丝生长速率法测定了2019—2021 年从河南省11 个地区采集并分离得到的278 株禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性，旨在持续性监测河南省禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性水平以及田间是否有抗性群体的产生，为今后田间抗药性监测及合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试药剂：95%丙硫菌唑 (prothioconazole) 原药 (山东海利尔化工有限公司)。

供试培养基：PSA 培养基 (马铃薯200 g，琼脂17 g，蔗糖20 g，用去离子水定容至1000 mL)。

绿豆汤培养基 (绿豆30 g，用去离子水定容至1000 mL)。

WA (water-agar) 培养基 (琼脂17 g，用去离子水定容至1000 mL)。

供试菌株的培养及鉴定：2019—2021 年在河南省不同地区采集小麦赤霉病病穗样本，用无菌镊子将染病麦粒或穗梗在无水乙醇里浸泡5～10 s，然后用无菌水冲洗3 次，以无菌定性滤纸吸干水分后在含质量浓度为100 μg/mL 硫酸链霉素的PSA 平板上培养。待培养基长出粉红色菌落后，打取菌饼转入3% 绿豆汤培养基中，置于摇床上，于25 ℃、120 r/min、12 h 光照/12 h 黑暗的条件下进行摇培，5 d 后在WA 培养基上划线挑单孢。利用禾谷镰孢菌特异性引物 (Fg-F，5′-TTC TTTGACATCTGTTCAACCCA-3′，Fg-R，5′-ACAGATGACAAGATTCAGGCACA-3′，280 bp)进行分子鉴定，明确其所属种为禾谷镰孢菌F.graminearum[15]，将分离得到的菌株在PSA 斜面上4 ℃条件下保存。

1.2 禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性测定

采用菌丝生长速率法[16]测定2019—2021 年采集的禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性。用丙酮将丙硫菌唑原药溶解并配制成质量浓度为10 mg/mL的母液，再用丙酮将母液逐级稀释成至0.3125、0.625、1.25、2.5 和5 mg/mL，等量加入PSA 培养基中 (每200 mL PSA 中加入200 μL)，制成药剂最终质量浓度分别为0.3125、0.625、1.25、2.5 和5 μg/mL 的含药平板 (直径为9 cm)。以含相同质量浓度丙酮的平板为对照。将供试菌株在PSA 平板上25 ℃培养3 d 后，打取直径为5 mm 的菌饼并接种于培养皿中央。每处理3 次重复。置于25 ℃培养箱内黑暗培养3 d，采用十字交叉法测量各菌株菌落直径，并按公式 (1) 计算各药剂处理下菌丝生长抑制率。

式中：I为菌丝生长抑制率，%；D0为对照菌落直径，cm；Dt为处理菌落直径，cm。

1.3 数据处理

采用DPS v7.05 数据处理软件处理数据，得出药剂抑制菌丝生长的毒力回归方程、相关系数(r) 和有效抑制中浓度 (EC50)，采用显著性最小差异法 (Least-Significant Difference，LSD，P＜ 0.05)进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 2019—2021 年河南省禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性

由图1 可以看出：供试278 株禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性频率直方图为单峰曲线，呈近似正态分布，表明尚无田间抗药性群体产生。各菌株EC50值在0.609～3.868 μg/mL 之间，近80%菌株的EC50值分布在0.800～2.400 μg/mL，最大值为最小值的6.35 倍，平均EC50值为(1.741 ±0.690) μg/mL。

图1 供试278 株禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的频率分布Fig.1 The frequency distribution of EC50 values of 278 F.graminearum strains to prothioconazole

2.2 不同年份间禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性差异

结果 (表1) 表明：不同年份间，禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性水平无显著性差异，其中：2020 年的83 株菌为最不敏感，平均EC50值为(1.894 ± 0.652) μg/mL；2021 年的104 株菌株最为敏感，平均EC50值为(1.643 ± 0.701) μg/mL；2019 年的91 株菌株较为敏感，平均EC50值为(1.715 ± 0.695) μg/mL。每一年的平均EC50值与3 年的平均值间均无显著差异，表明2019—2021年禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性水平无显著变化。2019 年菌株间敏感性差异最大，EC50最大值是最小值的6.35 倍，平均值低于2019—2021 年菌株平均水平。2020 年菌株间敏感性差异最小，EC50最大值是最小值的4.46 倍，平均值高于2019—2021 年菌株平均水平。

表1 不同年份间禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性Table 1 Sensitivity of F.graminearum to prothioconazole in different years

2.3 不同地区间禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性差异

不同地区间，禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性水平有显著性差异。由表2 数据可以看出：济源地区的菌株最不敏感，开封地区的菌株最敏感。焦作市菌株间敏感性差异最大，EC50最大值是最小值的6.21 倍；新乡市菌株间敏感性差异最小，EC50最大值仅是最小值的1.75 倍。

表2 不同地区间禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F.graminearum to prothioconazole in different regions

3 结论与讨论

近年来，有关禾谷镰孢菌对三唑类杀菌剂的敏感性研究报道较多。张铭等测定了采自不同省份的100 株小麦赤霉病菌对叶菌唑的敏感性，结果显示，供试菌株的EC50值在0.04～0.51 μg/mL之间，平均值为(0.18 ± 0.09) μg/mL，且敏感性频率分布呈近似正态分布，由此建立了敏感性基线[17]。徐建强等采用菌丝生长速率法测定了采自河南省不同县 (市) 共113 株小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性，结果显示，供试菌株对戊唑醇的EC50值范围在0.010～0.237 μg/mL，平均值为(0.057 ± 0.041) μg/mL，敏感性频率分布图显示，超80% 的菌株的敏感性频率分布呈近似正态分布，因此可将此部分菌株的平均EC50值(0.041 ±0.016) μg/mL 作为小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性基线[18]。本研究采用菌丝生长速率法测定了河南省各地区禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性，结果显示：河南省在2019—2021 收集的278 株菌株的平均EC50值为(1.741 ± 0.690) μg/mL，其敏感频率分布图为单峰曲线，呈近似正态分布，表明无田间抗药性群体产生。而且，与先前建立的河南省禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性基线(1.776 ± 0.667) μg/mL 一致，表明2019—2021年禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性水平无变化[14]。通过比较不同年份的菌株可知，2020 年菌株最不敏感，平均EC50值为(1.894 ± 0.652) μg/mL；2021 年菌株最敏感，为(1.643 ± 0.701) μg/mL。通过比较不同地区的平均EC50值可知，各地区间禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性水平有显著性差异，其中济源市的菌株最不敏感，开封市的菌株最敏感。由于取样各采集地对于丙硫菌唑或其他三唑类杀菌剂的用药历史和用药水平并不清楚，推断测定结果中呈现的不同区域间的敏感性差异可能是与各地赤霉病流行及发生程度、用药次数和用药量有关。此外，新乡市和驻马店市两地的菌株间敏感性差异小可能与其样本数较少有关，为进一步完善研究，我们后续将增加菌株采集的数量，持续性监测这两个地区以及省内其他地区禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性。

丙硫菌唑不仅具有较高的杀菌活性，而且能够有效抑制由赤霉病产生的各种毒素，是我国用于防控小麦赤霉病的主要药剂[13]。吴佳文等通过田间试验与室内测定发现，其单剂 (48%丙硫菌唑悬浮剂 (SC) 施药剂量 (有效成分，下同) 288 g/hm2)及复配剂 (40% 丙硫 • 戊唑醇SC 施药剂量240 g/hm2) 对小麦赤霉病均有良好的防治效果，药后25 d 的防效为89.64%～91.71%[19]。此外，他们还发现48%丙硫菌唑SC 有效成分252、288 g/hm2处理组中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 的检出量明显低于空白对照，对DON 具有很强的抑制效果[19]。马勇等测定了田间条件下施用丙硫菌唑单剂及其复配剂对小麦赤霉病的防治效果。结果显示，25%丙硫菌唑SC 在有效成分 187.5 g/hm2下对小麦赤霉病的防治效果达76.38%，15%丙硫 •戊唑醇SC 在270 g/hm2下的防治效果达75.12%，均能有效控制小麦赤霉病[20]。

本研究在实验室已建立的河南省禾谷镰孢菌对丙硫菌唑的敏感性基线的基础上，持续监测了2019—2021 年间河南省禾谷镰孢菌对其敏感性水平变化。结果显示，尚未在田间发现抗性菌株，且敏感性水平基本一致。考虑到杀菌剂对病害的作用效果在自然条件下要受品种、气候等其他因素的影响，室内试验得出的结果仅可作为理论依据，田间药效试验还有待于下一步研究。同时，为延缓禾谷镰孢菌对丙硫菌唑抗药性的产生和发展，应在小麦的生长季节中控制其使用次数，建议与其他不同作用机制的杀菌剂交替或复配使用。