樱桃黑斑病菌对氟唑菌酰羟胺的敏感性

轷思玲, 李阿根, 杨晓琦, 张传清*,

(1.浙江农林大学 现代农学院，杭州 311300；2.杭州市余杭区农业生态与植物保护管理总站，杭州 311100)

樱桃 (Cerasusspp.) 属蔷薇科樱属植物，黑斑病是其重要病害之一，病原菌为交链格孢Alternaria alternata[1-3]。黑斑病在樱桃果实上的危害症状主要表现为果实表面有大小不一轮纹状的黑色斑块，严重时会凹陷或开裂、腐烂，并且有浓密黑色霉层。由樱桃黑斑病导致的樱桃采后腐烂现象也较为严重[2]。目前国内对樱桃黑斑病的化学防治研究很少。琥珀酸脱氢酶抑制剂 (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs) 在国内外被应用于链格孢病害的防治，如在美国通常使用啶酰菌胺防治由A.alternata引起的开心果腐烂病[4]，氟吡菌酰胺对链格孢A.alternata也有较强的抑菌活性[5]，本课题组前期也报道了啶酰菌胺在由A.alternata引起的烟草赤星病防治上有很好的应用前景[6]。

真菌中的SDH 复合物包括4 个亚基：1 个黄素蛋白 (SDHA)、1 个铁硫蛋白 (SDHB) 和2 个嵌膜蛋白 (SDHC 和SDHD)[7]。近年来，作用于真菌呼吸链线粒体复合物II 的SDHIs 杀菌剂新品种陆续商品化[8]，SDHIs 杀菌剂与由SDHB、SDHC 和SDHD 3 个亚基的部分氨基酸残基组成的泛醌结合Q 位点相结合[9-10]，从而阻碍呼吸电子传递，影响三羧酸循环，阻止病原菌能量代谢。氟唑菌酰羟胺 (pydiflumetofen) 是先正达作物保护公司开发的新型SDHIs 杀菌剂的代表品种，其与苯醚甲环唑的混剂于2020 年在中国获得登记[11]，田间防效表现优秀，而且环境风险系数较小，内吸输导性也相对较强[12]。该药剂目前在中国仅登记用于小麦赤霉病和油菜菌核病等病害的防治，其对由A.alternata引起的樱桃黑斑病的防治效果还未见系统报道。鉴于此，本研究测定了采集自中国不同地区的A.alternata群体对氟唑菌酰羟胺的敏感性，并建立了敏感性基线，评估了氟唑菌酰羟胺在黑斑病防治上的应用潜力，旨在为其应用于樱桃黑斑病及其他链格孢病害的防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试A.alternata菌株共103 株，均为2020—2021 年分离所得，其中山东28 株、四川9 株、河北33 株、浙江18 株、江苏15 株，供试菌株保存于浙江农林大学杀菌剂与植物病害治理实验室。将菌株接种于PDA 培养基，在25 ℃、黑暗条件下培养5 d 后进行活化转接培养，置于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2 供试药剂

200 g/L 氟唑菌酰羟胺悬浮剂 (pydiflumetofen 200 g/L SC) 和98 %氟唑菌酰羟胺原药，由瑞士先正达作物保护有限公司提供，原药用丙酮溶解配制成40 000 μg/mL 母液，备用。

1.3 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基：马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g，无菌水定容至1 L。水琼脂培养基 (WA) 培养基：20 g 琼脂，无菌水定容至1 L。

1.4 对氟唑菌酰羟胺敏感性基线的建立

采用菌丝生长速率法[13]测定。将已稀释的氟唑菌酰羟胺与已灭菌的 PDA 培养基混合，配制成含氟唑菌酰羟胺最终质量浓度分别为1.2、0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375 μg/mL 的含药平板。将A.alternata菌株分别活化于PDA 培养基上，25 ℃预培养5 d 后，于菌落边缘打取直径为5 mm 的菌饼，分别接种至上述各浓度含药PDA 平板上，以未加入药剂的PDA 平板为对照，每浓度3 次重复。在25 ℃、黑暗条件下培养7 d 后采用十字交叉法测量菌落直径 (cm)，计算菌丝生长抑制率。利用 SPSS 22.0 软件，求出毒力回归方程、有效抑制中浓度(EC50值)及相关系数。以A.alternata菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性区间为横坐标，以菌株数及各个区段中菌株出现的频率为纵坐标，建立敏感性分布图[6,14]。

1.5 SDH 基因序列分析

为进一步分析A.alternata菌株对氟唑菌酰羟胺敏感性差异与SDH基因突变的关系，选取EC50值高 (QHD-3、YTMZ-38-3、YTHD-38-1) 和低 (LYHD-2、YTMZ-35、YTHD-7) 的菌株各3 株，分别采用CTAB 法提取菌株DNA 并以之为模板，参考Mallik 等[5]设计的引物 (表1) 进行PCR 扩增以及SDHB/C/D基因序列比对。A.alternata基因SDHB、SDHD和SDHC的公开序列(NCBI 登录号分别为EU178851.1、FJ437067.1 和FJ437068.1)。SDHB基因序列的反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃停止反应。SDHC/D基因序列的反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃停止反应，将 PCR 扩增产物送至杭州有康生物有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN 6.0 生物软件进行分析。

1.6 抑制孢子萌发活性的测定

采用孢子萌发法[15]，随机选择A.alternata菌株 YTMZ-38-3、QHD-3、LYHD-2 和YTHD-7，用涂布器刮洗分生孢子后，经无菌纱布过滤制得孢子悬浮液，将孢子悬浮液浓度调至105～106个/mL。将已灭菌的WA 培养基与各浓度的氟唑菌酰羟胺混合，配制成最终质量浓度分别为1.2、0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375 μg/mL 的含药WA 平板。取100 μL 孢子悬浮液均匀涂布于含药WA 平板上，以滴加100 μL 无菌水为空白对照，晾干后置于25 ℃、黑暗条件下培养5 h，观察孢子萌发情况，记录视野孢子总数及孢子萌发数。每处理3 次重复。计算各处理的孢子萌发抑制率，根据药剂质量浓度对数值与抑制几率值求出相应的EC50值。

1.7 保护和治疗作用的测定

选择EC50值最高和最低的各3 株A.alternata菌株制备孢子悬浮液。将樱桃果实表面用无菌接种针创造伤口后，将200 g/L 氟唑菌酰羟胺悬浮剂用无菌水稀释成有效成分质量浓度分别为1.2、0.3、0.0375 μg/mL 的氟唑菌酰羟胺药液，并用小型喷雾器喷施，以果实表面均匀润湿，无液滴滴下为准。以喷施无菌水作为对照组，置于室温下晾干。保湿培养 (25℃，RH 80%) 24 h 后接种20 μL 孢子悬浮液，测定其保护作用。治疗作用则是先将20 μL 孢子悬浮液接种于樱桃果实表面创口处，保湿培养 (25℃，RH 80%) 24 h 后再用小型喷雾器分别喷施1.2、0.3、0.0375 μg/mL 的氟唑菌酰羟胺药液。于接种后4 d 根据分级标准[16-17]调查发病情况：0 级，无病斑；1 级，病斑面积占整个果实面积的5% 以下；3 级，病斑面积占整个果实面积的5%～20%；5 级，病斑面积占整个果实面积的 ＞20%～50%；7 级，病斑面积占整个果实面积的 50% 以上。计算各处理病情指数及防治效果，利用SPSS 22.0 软件，根据浓度对数值与病害防治效果几率值求出相应的回归方程、EC50值及相关系数。

2 结果与分析

2.1 A.alternata 对氟唑菌酰羟胺的敏感性基线

利用所测试的103 株A.alternata菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性绘制敏感性频率曲线，结果为单峰曲线，EC50值分布在0.027～1.175 μg/mL之间，敏感性差异系数 (最高EC50值/最低EC50值)为43.5，平均EC50值为 (0.236 ± 0.101) μg/mL。从敏感性分布图 (图1) 可以看出，A.alternata群体对氟唑菌酰羟胺的敏感性呈连续分布，故其平均EC50值可以作为敏感性基线，用于后续的抗药性监测。

图1 A.alternata (n = 103) 对氟唑菌酰羟胺的敏感性分布频率Fig.1 Sensitivity distribution frequency of A.alternata ( n = 103 ) to pydiflumetofen

2.2 SDH 基因序列比对结果

通过软件DNAMAN 6.0 对6 株病原菌分别进行了SDH基因的序列比对分析，发现4 个不同敏感性菌株不同位点碱基发生了改变 (表2)。其中EC50值最大的QHD-3 菌株SDH基因有5 处突变，分别为SDHB(S23F，E258K)、SDHC(I156T)和SDHD(G182V)；其他敏感性菌株也存在不同的位点突变，如YTMZ-38-3 中存在SDHB的E258K突变，YTHD-38-1 中存在SDHC的Q8L、I156T和R5Q 突变，YTHD-7 中存在SDHB的T15I、S23F和R24C 以及SDHD的G182I 突变，但没有发现这些核苷酸多样性与A.alternata对氟唑菌酰羟胺的敏感性有明显的联系。

表2 不同A.alternata 菌株的SDH 基因序列的差异Table 2 Mutation sites of SDH gene and corresponding amino acids in different A.alternata isolates

2.3 氟唑菌酰羟胺对A.alternata 菌丝生长和孢子萌发的抑制活性

如表3 所示，氟唑菌酰羟胺对A.alternata菌株的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用，其中对菌株 QHD-3 的孢子萌发抑制效果与菌丝生长抑制效果均不如其他菌株，菌株 LYHD-2 菌丝生长对氟唑菌酰羟胺最敏感，EC50值为 0.027 μg/mL ，而菌株 YTHD-7 的孢子萌发对氟唑菌酰羟胺最敏感，EC50值为0.031 μg/mL。

表3 氟唑菌酰羟胺对A.alternata 菌丝生长和孢子萌发的抑制活性EC50 值Table 3 EC50 values of pydiflumetofen against mycelia growth and spore germination of A.alternata

2.4 保护和治疗作用

测定结果(表4，图2)表明：在接种A.alternata孢子悬浮液 48 h 后，樱桃开始发病，不同剂量的氟唑菌酰羟胺均对樱桃黑斑病有较好的防治效果，且随着药剂质量浓度的升高，防治效果增强。1.2 μg/mL 的氟唑菌酰羟胺的治疗作用防治效果为57.14 %～71.43 %，而在保护作用效果测定中，1.2 μg/mL 的氟唑菌酰羟胺的保护作用防治效果为92.83%～99.96%，即使在0.3 μg/mL 剂量下，其保护作用仍明显优于治疗作用，说明氟唑菌酰羟胺对樱桃黑斑病具有较好的抑菌效果，且整体的保护作用优于治疗作用。

图2 氟唑菌酰羟胺对樱桃黑斑病的保护及治疗作用Fig.2 Protective and curative effects of pydiflumetofen on cherry black spot

表4 氟唑菌酰羟胺对樱桃黑斑病的保护和治疗作用防效Table 4 Protective and curative effects of pydiflumetofen on cherry black spot disease

3 讨论

樱桃是一种颇受消费者喜爱的水果，栽培面积和规模不断扩大，因此樱桃生产中的病虫害问题也不断引起种植者的关注。目前生产上防治樱桃各病害的药剂主要包括苯并咪唑类 (MBCs)、麦角甾醇14α-脱甲基酶抑制剂合成类杀菌剂 (DMIs)、甲氧基丙烯酸酯类 (QoIs) 和琥珀酸脱氢酶类抑制剂 (SDHIs) 等化学药剂[8]。生物防治方面主要利用植物精油等来降低樱桃果实采后的腐烂率以延长贮藏期，保障其品质[18]。因此，筛选高效、低毒杀菌剂用于樱桃种植过程中以及采后病害的防治，对樱桃产业的发展具有重要意义。

赵远征[19]室内抑菌活性测定结果表明，咪鲜胺、腈菌唑和苯醚甲环唑对A.alternata菌丝生长和孢子萌发均有较好的抑制效果。本研究测定了A.alternata群体 (n= 103) 对氟唑菌酰羟胺的敏感性，结果表明，氟唑菌酰羟胺对103 株A.alternata菌株的EC50值范围为0.027～1.175 μg/mL，频率分布曲线呈连续的单峰分布，其平均值 (0.236 ±0.101) μg/mL 可作为A.alternata菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性基线，为后续该菌株抗药性监测和有效防治田间樱桃黑斑病提供了科学依据[20]。氟唑菌酰羟胺作为SDHIs 代表品种具有独特的作用方式，对多种植物病原菌抑制活性较高[21-22]，尤其是对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea[23]、多主棒孢菌Corynespora cassiicola[24]和油菜菌核Sclerotinia sclerotiorum等[25]防治效果优异。本研究发现，氟唑菌酰羟胺对樱桃A.alternata的 EC50值最高为1.175 μg/mL，最低为 0.027 μg/mL，两者相差43.5 倍，表明樱桃A.alternata对氟唑菌酰羟胺的敏感性存在一定差异，但所有供试A.alternata菌株的平均EC50值为 (0.236 ± 0.101) μg/mL，说明氟唑菌酰羟胺对其菌丝生长具有较好的抑制效果。

研究表明，A.alternata菌株对SDHI 类药剂的抗性突变发生于SDHB、SDHC 或SDHD 亚基中[26-27]，在已有的报道中，还未见SDHA 亚基上出现抗药性突变[28]。为了进一步探明该菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性差异是否由SDH基因突变导致，本研究分析了A.alternata菌株SDH基因序列的差异，虽然发现了不同病原菌的SDH基因存在核苷酸多态性，但是未发现SDHB、SDHC、SDHD亚基上存在与其对氟唑菌酰羟胺敏感性差异明显相关的氨基酸突变位点，由此认为这种敏感性差异并非其为天然抗性菌株而产生的抗药性突变，而是属于自然差异[29]。

氟唑菌酰羟胺对A.alternata菌株的孢子萌发表现出了很好的抑制活性，说明氟唑菌酰羟胺既可以抑制该病菌的孢子萌发，从而减少病原菌的初侵染，同时也能够很好地抑制其菌丝生长[30]，达到抑制病斑扩展的效果。进一步通过分析氟唑菌酰羟胺对樱桃黑斑病的保护和治疗防治效果发现，其在0.3 μg/mL 剂量下即可表现出良好的保护作用，且保护作用优于治疗作用，表明氟唑菌酰羟胺对于防治樱桃黑斑病的发生具有良好的应用前景。建议在樱桃黑斑病发病前或发病初期使用氟唑菌酰羟胺进行防治，也可考虑应用在采后储存运输期使用，以减少储存过程中因病害发生造成的损失，但其在田间的实际应用效果还有待进一步研究。