拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

2023-04-11渠清刘宁邹金鹏张雅璇贾慧孙蔓莉曹志艳董金皋

中国农业科学 2023年6期

渠清，刘宁，邹金鹏，张雅璇，贾慧，孙蔓莉，曹志艳，董金皋

1河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001；2河北省植物生理与分子病理学重点实验室/华北作物改良与调控国家重点实验室，河北保定 071001；3河北农业大学植物保护学院，河北保定 071001

【目的】拟轮枝镰孢（）引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一，论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异，为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序，之后采用生物信息学分析，分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考，以|log2FC|≥1，-adjust＜0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因，利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1 945个基因上调表达，有9、302和1 784个基因下调表达；玉米分别有293、692 和1 426个基因上调表达，320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示，侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长，差异基因主要富集在RNA生物合成、细胞壁结构成分、脂肪酸生物合成、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物过程和代谢过程等通路中。拟轮枝镰孢早期侵染触发了玉米活性氧（ROS）爆发，差异基因主要富集在对活性氧、过氧化氢的反应，几丁质酶、单加氧酶活性，木质素代谢过程等相关通路中。侵染后期拟轮枝镰孢继续在籽粒中定殖及扩展，差异基因主要富集在碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程、跨膜转运、氧化还原酶活性等功能通路中。玉米主要通过苯丙素、木质素、类黄酮生物合成，MAPK 信号通路、植物-病原互作和植物激素信号转导等途径差异基因大量表达响应病原菌侵染。随机选取6个玉米和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因进行qRT-PCR分析，基因表达规律与转录组测序结果一致，证实了RNA-seq的准确性。【结论】在病原菌侵染早期，拟轮枝镰孢在细胞间隙生长，触发玉米活性氧爆发，相关通路差异基因表达；侵染中后期，病原菌以淀粉为营养素，继续在籽粒中定殖及扩展，玉米通过苯丙素、木质素及几丁质酶的生物合成等方面的相关基因表达响应拟轮枝镰孢侵染，同时植物-病原互作、MAPK途径和激素信号转导等途径参与抗拟轮枝镰孢侵染。

拟轮枝镰孢；玉米穗腐病；转录组；植物-病原互作；基因表达; 差异表达基因

0 引言

【研究意义】玉米穗腐病是由包括镰孢菌和霉菌在内的多种病原菌侵染玉米果穗引起的重要病害，在我国多个玉米产区均有发生。其中拟轮枝镰孢（）是玉米穗腐病的主要致病菌之一，在我国多个地区玉米穗腐病致病真菌中所占比例最大[1]。该病害除了降低玉米产量外，拟轮枝镰孢还产生有毒的次级代谢产物——伏马毒素，严重影响玉米质量。伏马毒素可分为伏马毒素B1（FB1）、B2（FB2）和B3（FB3）3种，其中FB1含量最多且毒性最强[2-3]，其不仅可毒害动物，造成马白头软化症、猪肺水肿和大鼠肝癌，还与人类癌症有关[4-5]，严重影响食品及饲料安全。目前对玉米穗腐病的防治主要以种植抗病品种为主，但玉米与病原菌互作过程中植物抗病应答机制和病原菌的致病机制仍不清楚，有待于进一步深入解析其相互作用机理，为抗病分子育种提供参考。【前人研究进展】植物与病原真菌互作过程中，真菌可通过侵染垫、附着胞、吸器等侵染结构帮助其成功入侵寄主，造成植物感染[6]。镰孢菌没有穿透宿主细胞的特殊结构，如附着胞或吸器，但其孢子可通过植物的自然孔口或者伤口进入宿主细胞完成侵入[7]。此外，还可产生一系列细胞壁降解酶，不仅能够消化植物细胞壁的纤维素、木聚糖和果胶的聚合物并以此作为真菌的重要营养来源，还能通过降解植物蜡质层、角质层和细胞壁而导致宿主发病[8]，从而完成入侵和病原体传播。在互作过程中，真菌还会产生毒素。真菌释放碱性蛋白导致酶活性发生变化，受到伏马毒素FB1污染的谷物种子表现出胚乳降解、淀粉颗粒周围缺少蛋白质基质的性状，这种毒素通过积累有毒鞘脂中间产物破坏植物和动物的质膜[9]。这些中间产物破坏了鞘脂的从头合成，抑制了神经酰胺合成酶[10]，因此，破坏了细胞信号和功能，改变了细胞凋亡和复制。植物拥有复杂的免疫系统，可以保护其免受病原菌的侵害，包括病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）触发免疫（pattern-triggered immunity，PTI）和效应器触发免疫（effector-triggered immunity，ETI）[11]。PTI和ETI触发信号级联，包括细胞内Ca2+浓度的改变、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及次级信号分子的产生等。钙结合蛋白可以检测到细胞内Ca2+水平的增加，作为第二信使调控下游基因表达，在植物抗病中发挥重要作用。同时ROS生成速率的快速增加也是植物应对病原体侵染的基本反应，称为“氧化爆发”[12]。ROS能够激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径，上调特定应激相关基因的表达[13]。植物激素在调节植物对各种生物和非生物胁迫的反应所涉及的发育过程和信号网络中同样发挥着重要作用[14]。大量研究显示，植物产生的乙烯（ET）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）在介导植物抗病反应中起主要作用。当病原菌侵染时，这些植物激素的合成相关基因表达水平增加，又进一步诱导和加强了植物免疫反应，实现对不同病害的抵抗[15-17]。【本研究切入点】本课题组前期对我国多个省份玉米果穗的穗腐病病原菌进行分离，发现拟轮枝镰孢的分离频率最高，同时通过荧光标记菌株研究多种镰孢菌侵染玉米果穗的效能，发现拟轮枝镰孢在侵染玉米果穗中表现出竞争优势[18]。目前对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒过程中，不同抗/感玉米品种响应病原菌侵染相关过程的转录分析较多[19-20]，但对宿主与病原菌双方互作过程的进程开展系统的转录水平研究较少。【拟解决的关键问题】分别以单独培养的拟轮枝镰孢和未接菌的玉米籽粒为对照，利用高通量转录测序技术对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒4、12和72 h的样品进行转录组测序，分析互作过程中玉米和拟轮枝镰孢双方的差异基因表达情况，明确拟轮枝镰孢与玉米互作的生物学过程，以期为揭示寄主和病原菌互作及穗腐病抗性机理提供参考依据。

1 材料与方法

试验于2020—2022年在河北农业大学完成。

1.1 供试材料

供试植物：玉米品种为自交系B73，种子由沈阳农业科学院刘新芳老师馈赠。玉米B73种植于河北农业大学东校区温室，行间距为60 cm，株间距为30 cm，正常管理。

供试病原菌：供试病原菌为拟轮枝镰孢Fv7600，菌株由南京农业大学顾沁老师馈赠，河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室保存。接种于PDA（potato dextrose agar）培养基，于25℃黑暗培养。

1.2 病原菌接种

将PDA平板上活化后的拟轮枝镰孢用直径为6 mm的打孔器打取菌盘，接种到羧甲基纤维素钠（CMC）液体培养基中25℃黑暗振荡培养5—7 d后，三层无菌纱布过滤，无菌水稀释成1×106个/mL的孢子悬浮液备用。待自交系玉米B73人工授粉21 d后，用1 mL注射器针头蘸取拟轮枝镰孢孢子悬浮液针刺玉米籽粒接种[21]。分别于接种后0 h（mock）、4 h（Fv4）、12 h（Fv12）和72 h（Fv72）后取样，每个时间点接种3个果穗作为生物学重复。同时使用PDA培养基上25℃黑暗培养72 h的拟轮枝镰孢（Fv）作为真菌的对照。所有样品取样后立即在液氮中冷冻，-80℃下储存，以提取RNA。

1.3 转录组测序

1.3.1 RNA提取、文库构建及测序转录组测序是基于Illumina Novaseq 6000 测序平台，对真菌菌丝、玉米籽粒和互作时期的玉米籽粒样品转录出来的所有mRNA进行测序，测序试验采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法进行文库构建，具体如下：使用Trizol法分别提取真菌菌丝、玉米籽粒和互作玉米样品总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳分析所提取的总RNA的完整性及是否存在DNA污染，使用NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific）和Agilent 2100 Nano（Fisher Scientific）仪器分析总RNA的质量和完整性。构建了15个RNA文库（分别命名为Mock、Fv、Fv4、Fv12和Fv72，每处理3个重复）。转录组测序由上海美吉生物处理完成。使用Novaseq 6000测序平台获得原始数据，通过对原始测序数据进行质控，得到高质量的数据并对其进行统计以及质量评估，质控后得到 clean reads。将质控后的clean reads分别与玉米和拟轮枝镰孢的参考基因组比对。使用StringTie软件对每个样本进行拼接组合，对拼接之后的结果进行统计。数据已上传NCBI数据库，SRA登录号为PRJNA735336。

1.3.2 差异表达基因（DEG）的筛选利用RSEM表达定量软件分别对基因和转录本的表达水平进行定量分析，定量指标为TPM，即以转录本的条数为计算单位，使用转录本的条数代替拼接片段数。使用DESeq2软件以mRNA的-adjust＜0.05&|log2FC|≥1为标准对读取clean reads进行统计分析，获得差异表达的mRNA（DEG）。以归一化处理后的log2FC的值绘制热图。

1.3.3 差异表达基因GO和KEGG富集分析采用Goatools软件，Fisher 精确检验的方法对差异表达基因进行基因本体论GO富集分析以及京都基因和基因组百科全书KEGG富集分析，从而获得差异基因主要GO功能和KEGG富集通路。当经过校正的值（value）＜0.05时，认为此GO功能和KEGG功能存在显著富集。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证

随机选取6个玉米的差异表达基因和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因，对其进行qRT-PCR检测。使用RNA提取试剂盒提取总RNA（北京聚合美生物科技有限公司），采用cDNA PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser第一链合成试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）反转录合成cDNA，将其作为模板，使用Super EvaGreen qPCR Master Mix 试剂盒（US EVERBRIGHT INC 公司）进行qRT-PCR检测，玉米使用作为内参基因，拟轮枝镰孢使用作为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。20 μL qPCR反应体系：SYBR Mix 10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板1 μL、ROX 1 μL和ddH2O 7.2 μL。反应程序：95℃预变性 2 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，45个循环。试验数据采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，应用检验法进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 转录组测序结果评估

对接种拟轮枝镰孢后0、4、12和72 h的玉米籽粒样品和培养基上培养3 d的拟轮枝镰孢进行转录组测序。本研究构建了15个转录组文库，其中包括5个样本，每个样本有3个生物学重复。15个转录组文库的测序结果显示，在去除reads中的接头序列、低质量片段和N率（N表示不确定碱基信息）较高序列及长度过短序列后，总共获得1 169 261 200 clean reads。接菌后0 h的样品（Mock）分别获得了51 110 882、50 311 356和44 387 490 clean reads。真菌菌丝样品（Fv）的3个重复数据显示，分别获得了45 922 668、49 966 126和40 694 544 clean reads。接菌后4 h的样品（Fv4）获得了101 474 514、95 247 160和83 492 592 clean reads。接菌后12 h的样品（Fv12）获得了102 019 788、106 427 588和106 395 294 clean reads。接菌后72 h的样品（Fv72）获得了107 478 816、103 103 634和81 228 748 clean reads（表2）。将各样品的clean reads分别比对到玉米B73和拟轮枝镰孢的基因组上，玉米中的比对率介于91.63%—95.46%。由于接菌时间较短，大部分为玉米籽粒的样品，籽粒中拟轮枝镰孢带菌量和所占比例相对较少，虽然互作样品的数据比对到真菌基因组的比对率较低，但真菌的对照比对到拟轮枝镰孢基因组的比对率均在95%以上，所有文库的Q30均在93.59%以上。因此，测序得到的数据是可靠的，并且可以用于后续的分析。

表1 本研究所用实时荧光定量 PCR引物信息

表2 转录组测序数据统计

-：未比对 Not blast

2.2 互作过程中拟轮枝镰孢和玉米籽粒中差异表达的基因

2.2.1 拟轮枝镰孢中差异表达的基因选择TPM＞1作为基因表达的衡量标准，以PDA培养基中生长3 d的菌丝（Fv）为对照，接种拟轮枝镰孢4 h（Fv4）、12 h（Fv12）和72 h（Fv72）的样本计算基因表达情况，结果显示（图1-A），Fv中有10 618个基因表达，Fv4、Fv12和Fv72中分别有2 193、5 249和9 844个基因表达，各处理间共同表达的基因数为1 736。与Fv相比，Fv4、Fv12和Fv72中分别有5、33和422个独特表达的基因。为了鉴定参与拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒的相关基因，进一步筛选了试验组和对照组之间差异表达的基因。共筛选出4 152个差异基因，3个时间点共同差异表达的有42个基因，Fv4和Fv12 共同差异表达的有6个基因，Fv4和Fv72共同差异表达的有55个基因，Fv12和Fv72 共同差异表达的有283个基因（图1-B）。同Fv相比，Fv4、Fv12和Fv72分别有140、400和1 945个差异基因上调表达，3个时间点共同上调表达的有38个差异基因，Fv4和Fv12共同上调表达的有4个差异基因，Fv4和Fv72共同上调表达的有47个差异基因，Fv12和Fv72共同上调表达的有151个差异基因（图1-C）。Fv4、Fv12和Fv72分别有9、302和1 784个差异基因下调表达，3个时间点共同下调表达的有4个差异基因，Fv4和Fv12共同下调表达的有2个差异基因，Fv12和Fv72共同下调表达的有94个差异基因（图1-D）。结果显示，与在培养基中单独培养相比，拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒的早期差异表达基因较少，菌丝以营养生长的方式在玉米籽粒中生长，但随着时间延长，基因表达出现显著差异，不仅激活大量基因的表达，同时抑制了相当数量的基因表达。

2.2.2 玉米中差异表达的基因选择TPM＞1作为基因表达的衡量标准，以接种无菌水（mock）为对照，接种拟轮枝镰孢4 h（Fv4）、12 h（Fv12）、72 h（Fv72）的样本计算基因表达情况，结果显示（图2-A），对照处理中有19 706个基因表达，Fv4、Fv12和Fv72玉米籽粒中分别有20 173、20 657和20 169个基因表达，各处理间共同表达的基因数为18 743。与mock相比，Fv4、Fv12和Fv72玉米籽粒中分别有160、484和535个独特表达的基因。为了鉴定玉米籽粒抵御拟轮枝镰孢侵染的相关基因，进一步筛选了试验组和对照组之间差异表达的基因。共筛选出2 778个差异基因，3个时间点共同差异表达的有64个基因，Fv4和Fv12共同差异表达的有226个基因，Fv4和Fv72共同差异表达的有69个基因，Fv12和Fv72共同差异表达的有165个基因（图2-B）。同未接菌的玉米籽粒相比，Fv4、Fv12和Fv72分别有293、692和 1 426个差异基因上调表达，3个时间点共同上调表达的有39个差异基因，Fv4和Fv12共同上调表达的有73个差异基因，Fv4和Fv72共同上调表达的有21个差异基因，Fv12和Fv72共同上调表达的有144个差异基因（图2-C）。Fv4、Fv12和Fv72分别有320、482和153个差异基因下调表达，3个时间点共同下调表达的有10个差异基因，Fv4和Fv12共同下调表达的有111个差异基因，Fv4和Fv72共同下调表达的有29个差异基因，Fv12和Fv72共同下调表达的有11个差异基因（图2-D）。结果显示，拟轮枝镰孢侵染后玉米籽粒更多的基因显示表达上调的趋势，且随着侵染时间延长上调表达基因的个数迅速增加。

A：样本间基因表达的维恩图Venn of gene expression among samples；B：接种4、12和72 h拟轮枝镰孢中差异基因的维恩图Venn of DEGs in F. verticillioides after inoculation at 4, 12 and 72 h；C：接种4、12和72 h后拟轮枝镰孢中上调表达差异基因的维恩图Venn of up-regulated DEGs in F. verticillioides after inoculation at 4, 12 and 72 h；D：接种4、12 和72 h后拟轮枝镰孢中下调表达差异基因的维恩图Venn of down-regulated DEGs in F. verticillioides after inoculation at 4, 12 and 72 h

A：样本间基因表达的维恩图Venn of gene expression among samples；B：接种4、12和72 h玉米中差异基因的维恩图Venn of DEGs in maize after inoculation with F. verticillioides at 4, 12 and 72 h；C：接种4、12和72 h后玉米中上调表达差异基因的维恩图Venn of up-regulated DEGs in maize after inoculation with F. verticillioides at 4, 12 and 72 h；D：接种4、12和72 h后玉米中下调表达差异基因的维恩图Venn of down-regulated DEGs in maize after inoculation with F. verticillioides at 4, 12 and 72 h

2.3 差异表达基因的代谢通路分析

2.3.1 拟轮枝镰孢的差异表达基因及富集分析对互作过程中拟轮枝镰孢的差异基因进行了GO富集分析（表3）。侵染4 h时拟轮枝镰孢差异基因较少，主要富集在RNA生物合成、细胞壁结构成分等功能通路中。侵染12 h后拟轮枝镰孢差异基因主要富集在肽生物合成和代谢过程、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物过程和代谢过程等功能通路中。侵染72 h后拟轮枝镰孢的差异基因主要富集在碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程、跨膜转运、氧化还原酶活性等功能通路中。

在KEGG富集分析中，侵染4 h拟轮枝镰孢的差异基因主要富集在脂肪酸生物合成通路中（图3-A），侵染12 h拟轮枝镰孢的差异基因主要富集在核糖体途径中（图3-B），侵染72 h拟轮枝镰孢的差异基因大量增加，主要富集在类固醇生物合成、淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化及精氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸等氨基酸的代谢通路中（图3-C）。

2.3.2 玉米的差异表达基因及富集分析对侵染后不同时间点的玉米差异基因进行了GO富集分析（表4）。接菌4 h后玉米的差异基因主要富集在对活性氧、过氧化氢的反应、几丁质酶、单加氧酶活性等相关通路中。接菌12 h后玉米的差异基因主要富集在对过氧化氢、非生物刺激的反应，木质素代谢过程及几丁质酶活性等相关通路中。病原菌侵染72 h后，差异基因主要富集在苯丙素、木质素、脂质生物合成过程，水杨酸、茉莉酸、活性氧代谢过程，几丁质酶和苯丙氨酸解氨酶活性等相关通路中。

KEGG富集分析结果显示，接菌后4 h玉米的差异基因主要富集在内质网中的蛋白质加工、苯丙素生物合成、MAPK信号通路中（图4-A）。接菌后12 h玉米的差异基因主要富集在内质网中蛋白质加工、苯丙素生物合成、二苯醚类、二芳庚烷类和姜辣素生物合成、淀粉与蔗糖代谢等通路中（图4-B）。接菌后72 h玉米的差异基因主要富集在苯丙素、二苯醚类、二芳庚烷类和姜辣素生物合成、类黄酮生物合成、MAPK 信号通路、植物-病原互作和植物信号转导等途径中（图4-C）。

2.4 玉米响应拟轮枝镰孢侵染的抗病通路

进一步分析玉米响应拟轮枝镰孢侵染中的抗病通路，包括植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导3条途径。植物-病原互作通路中，玉米响应拟轮枝镰孢侵染的差异表达基因分别在接菌后不同时间点响应病原菌侵染（图5）。聚类分析将该途径的差异基因分为两种类型，首先编码玉米CaMCML的基因、、在接菌早期就出现上调表达，这可能是由细胞内Ca2+浓度发生快速变化引起的；而其他基因主要是在病原菌侵染12或72 h时表达开始上调，但均为72 h表达量最高。例如呼吸爆发氧化酶Rboh（）在接菌12 h 就开始表达上调，72 h表达水平最高；WRKY33 转录因子（、）在接菌12 h后就开始上调表达，而其他WRKY33 转录因子（、、）在72 h表达迅速达到最大。同样在侵染后期表达高的基因还有钙依赖蛋白质激酶CDPK的基因（、）、诱导植物系统性抗性的基因PR1（、、）。

MAPK级联是受体/传感器下游高度保守的信号模块，可将细胞外刺激转化为真核生物的细胞内反应。植物MAPK信号通路在植物抵御病原体侵染的信号传递中起着关键作用。玉米抗拟轮枝镰孢侵染过程中，MAPK信号通路差异基因热图分析发现除了个别基因（）下调外，其他基因均表现为在72 h才出现表达上调（图6），例如MAPK信号途径中维持活性氧稳态的OXI1基因（）和MPK3/6基因（），在接菌后72 h均上调表达。

表3 拟轮枝镰孢侵染玉米不同时间点差异表达基因的 GO富集分析

BP：生物学进程Biological process； MF：分子功能Molecular function； CC：细胞组分Cellular component。表4同The same as Table 4

植物应对各种生物和非生物胁迫中，植物激素发挥着重要作用。转录组结果显示，玉米受到拟轮枝镰孢侵染后不同的激素信号响应了病原菌的侵染，而且各通路中不同基因存在前后差异（图7）。例如同样是茉莉酸（JA）信号通路中的关键基因JAZ（），在病菌侵染12 h后就检测到持续的显著上调，而在接菌后72 h JAZ的另外3个基因（、、）才发生表达上调。水杨酸（SA）信号通路中参与抗病的PR1基因（、、）在接菌后72 h上调表达。同样在后期72 h发生上调的还包括乙烯通路中EIN3基因（）和ERF1/2基因（、）。这表明茉莉酸信号通路的触发较早，而水杨酸信号通路和乙烯通路的触发是发生在接菌后72 h。其他受影响的信号通路基因还包括油菜素内酯通路和脱落酸通路相关基因，也参与了植物-病原互作过程。

图4 接种拟轮枝镰孢不同时间点后玉米中差异表达基因KEGG代谢通路富集分析

表4 玉米响应拟轮枝镰孢侵染不同时间点差异表达基因的GO富集分类

图5 玉米中植物-抗病通路差异表达基因

图6 玉米中MAPK信号通路差异表达基因

图7 玉米中植物激素信号转导途径差异表达基因

2.5 差异基因的qRT-PCR验证

利用qRT-PCR技术对随机选取的6个玉米的差异表达基因和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因在接种拟轮枝镰孢72 h后进行转录组数据验证（图8）。结果显示，玉米响应病原菌侵染的植物-病原互作途径中钙依赖蛋白激酶CDPK基因（、），茉莉酸介导的信号通路中JAZ基因（），植物激素信号转导途径中GH3 基因（、）和MAPK信号途径中WRKY 33转录因子（）在接种拟轮枝镰孢72 h后上调表达。在拟轮枝镰孢中，参与脂质生物合成的，参与脂质转运与代谢的羟基类固醇脱氢酶基因（），类固醇生物合成途径中的和，几丁质合酶基因（）和淀粉与蔗糖代谢途径中的在接种拟轮枝镰孢72 h后上调表达。以上12个差异基因的表达趋势和转录组测序结果一致，表明RNA-seq分析结果可靠。

图8 qRT-PCR验证拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒72 h后基因表达情况

3 讨论

由拟轮枝镰孢引起的玉米穗腐病严重影响玉米产量及品质，拟轮枝镰孢产生的伏马毒素对人、畜有毒害作用。由于化学农药防治穗腐病效果不佳，玉米抗性种质资源相对匮乏，因此明确玉米-拟轮枝镰孢互作中双方的调控过程变得更加迫切。唐科志等[22]利用转录组高通量测序分析发现，红橘被链格孢菌橘致病型（tangerine pathotype）侵染后，基础代谢遭到严重破坏，病程相关蛋白（PR）上调表达响应病原菌侵染。乙烯防御信号通路差异基因显著富集应对病原菌侵染。滕彩玲等[23]通过转录组测序分析，揭示了马蜂柑响应黄龙病菌（‘Liberibacter asiaticus’）侵染不同时期的生物学过程。史毅等[24]利用转录组测序分析匍匐翦股颖对立枯丝核菌（）的抗性，明确了病原菌侵染过程中寄主抑制病原菌扩散的抗病机制。

3.1 拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒的主要机制

在玉米-拟轮枝镰孢互作过程中，对不同玉米抗/感品种响应病原菌侵染的转录分析较多[19-20]，本文利用RNA高通量测序技术，对拟轮枝镰孢侵染玉米不同时期进行了转录组测序，分析玉米和拟轮枝镰孢双方差异表达基因的功能。首先发现，侵染初期拟轮枝镰孢只有少量差异基因主要富集在核糖体生物合成、细胞壁及脂肪酸生物合成途径中。脂肪酸可以通过调控菌丝的生长和无性孢子的产生来调控真菌的生长和发育[25-27]。这表明与在培养基中生长的菌丝相比，刚进入植物中的拟轮枝镰孢生长状态与其相似，接菌后4 h仍在细胞间隙生长，还未侵入植物细胞内。但此时玉米的差异表达基因富集在活性氧、过氧化氢的反应等方面，表明拟轮枝镰孢在细胞间隙的生长已经触发了活性氧爆发。在植物免疫系统中，活性氧的产生是植物早期抗病反应之一，起着至关重要的作用，不仅直接降低微生物的生存能力，还产生触发其他免疫反应的信号[28-30]。而且通过对植物-病原互作通路分析发现，CaMCML的基因、、在接菌后4 h上调表达，表明这种识别及反应是由细胞内Ca2+浓度发生快速变化引起的。

在接菌12 h后拟轮枝镰孢开始出现大量的差异表达基因，富集在蛋白质和碳水化合物代谢、木聚糖酶活性、几丁质结合相关通路，表明这段时间病菌生长旺盛，同时病菌产生降解植物细胞壁半纤维素结构的水解酶，从而破坏植物细胞。此时真菌侵染已经开始在玉米籽粒的细胞中定殖及生长[31]，而作为触发宿主PTI的细胞壁组分几丁质合成也增加。此时玉米的差异表达基因进一步集中在苯丙素生物合成、木质素和几丁质酶通路中，说明植物感知到真菌的侵染后通过木质化，形成病原菌入侵的第一道屏障，生物合成苯丙素等植物抗毒素。同时通过合成几丁质酶降解真菌的细胞壁几丁质成分，破坏拟轮枝镰孢细胞壁的同时产生的低聚物诱发了玉米PTI，因此在后续72 h，玉米中包括植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导在内的多种途径基因均表现为显著上调。而接菌72 h后，拟轮枝镰孢的差异基因主要富集在类固醇生物合成，淀粉和蔗糖代谢途径中，碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程，表明此时病菌开始大量利用植物细胞中的蔗糖和淀粉作为繁殖及进一步侵染的重要营养物质。此时，玉米中与苯丙素生物合成和代谢相关的基因上调。苯丙素可在植物中通过促进木质素沉积和类黄酮类植物抗毒素合成，对病原体感染作出反应[32-34]。

3.2 不同代谢通路介导的植物防御反应

在互作72 h时，玉米中包括植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导在内的抗病过程中大量差异基因较侵染前期相比显著上调。MAPK信号级联在调节植物生长发育和胁迫反应中发挥关键作用，包括植物防御激素的生物合成、信号传递、活性氧生成、气孔关闭、防御基因激活、植保素生物合成、细胞壁强化和超敏反应（HR）细胞死亡[35]。与其他植物激素在抗病中的报道一样，茉莉酸、水杨酸、乙烯等不同的激素信号通路也参与了植物与病原菌的互作，例如多个茉莉酸途径关键基因JAZ、乙烯通路的EIN3和ERF1/2 基因。笔者发现在植物-病原互作途径中，等多个及上调表达，表明它们参与了玉米的抗病。报道显示，WRKY转录因子在植物抗病中发挥重要作用，而且可以调节PR1等编码病程相关蛋白基因的表达以及茉莉酸、水杨酸等植物激素信号途径[36-37]。拟南芥中，WRKY33基因缺失突变体对灰葡萄孢（）和链格孢的敏感性增强，同时导致水杨酸水平升高而茉莉酸水平下调[38]。此外，BIRKENBIHL等[39]研究表明，WRKY33可直接靶向参与水杨酸、乙烯、茉莉酸等信号和钙调素生物合成的基因。因此本研究中多个在接菌后持续上调可能在调节抗病相关过程中发挥了重要的作用。

4 结论

拟轮枝镰孢先在玉米细胞间隙生长，后侵入细胞完成定殖，并利用宿主的营养物质进一步扩展。而玉米早期ROS爆发，后续通过几丁质酶参与的PTI、木质化、抗毒素合成抵抗病菌侵入，最终MAPK、植物激素等多种抗病相关通路基因均被激活。互作双方差异基因的挖掘为进一步研究抗拟轮枝镰孢玉米穗腐病提供了依据。

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Screening of Differential Genes and Analysis of Metabolic Pathways in the Interaction betweenand Maize Kernels

QU Qing1,2, LIU Ning2,3, ZOU JinPeng2,3, ZHANG YaXuan3, JIA Hui3, SUN ManLi2,3, CAO ZhiYan2,3, DONG JinGao2,3

1College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2Hebei Key Laboratory ofPlant Physiology and Molecular Pathology/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation, Baoding 071001, Hebei;3College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei

【Objective】 Maize ear rot caused byis one of the most serious diseases in maize producing areas in China. The objective of this study is to understand the differences in gene expression during the plant-pathogen interaction at different stages, and to provide a basis for pathogenic mechanism of the pathogen infection and resistance mechanism of maize.【Method】Illumina platform was used to sequence the transcriptome of maize kernels infected withat0, 4, 12, and 72 h.The differentially expressed genes (DEGs) of maize andwere screened with |log2FC|≥1,-adjust＜0.05 as threshold and clean reads were compared with genome of maize and, separately. Functional annotation and enrichment analysis of DEGs were carried out by using GO and KEGG databases. Goatools software was used to analyze the expression changes of genes related to plant-pathogen interaction, MAPK signaling pathway and plant hormone signal transduction pathway. Sequencing results were verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).【Result】A total of 140, 400 and 1 945 DEGs were up-regulated and 9, 302, and 1 784 DEGs were down-regulated inafter 4, 12 and 72 h interaction, respectively. A total of 293, 692, and 1 426 DEGs were up-regulated and 320, 482, and 153 DEGs were down-regulated in maize after 4, 12 and 72 h interaction, respectively. GO and KEGG enrichment analysis of DEGs showed thatgrew in intercellular space at the early stage of pathogen infection. The DEGs were enriched in RNA biosynthesis, cell wall structural component, fatty acid biosynthesis, protein metabolism, carbohydrate metabolism, biological process, and metabolic process. reactive oxygen species (ROS) was triggered in maize at the early stage of infection. The DEGs were enriched in response to ROS, hydrogen peroxide, chitinase activity, monooxygenase activity, lignin metabolism. At the later stage of infection,colonized and expanded in maize, and the DEGs were enriched in carbohydrate and cell wall polysaccharide catabolic process, transmembrane transport and oxidoreductase activity. Maize responded to pathogen infection through phenylpropanoid, lignin, flavonoid biosynthesis, MAPK signaling pathway, plant-pathogen interaction and plant hormone signal transduction. Six DEGs of maize and six DEGs ofwere randomly selected for qRT-PCR. The results were consistent with those of transcriptome sequencing, which confirmed the accuracy of RNA-seq.【Conclusion】at the early stage of infection,grew in the intercellular space, triggering ROS outbreak in maize and the expression of related pathway differential genes. At the middle and late stages of infection, the pathogen further colonized and expanded in maize with starch as nutrient. Maize responded to the infection ofthrough biosynthesis of phenylpropanoid, lignin and chitinase. Meanwhile, plant-pathogen interaction, MAPK signaling pathway, and plant hormone signal transduction were involved in the resistance to the infection of.

; maize ear rot; transcriptome; plant-pathogen interaction; gene expression; differentially expressed gene (DEG)