中性粒细胞在溃疡性结肠炎中的作用机制及临床应用研究进展

郑文涛 康锦钰 周颖 张谢 宋毓飞

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一类主要累及结直肠，肠道黏膜病变呈弥漫连续性，病程以复发和缓解交替为特征的慢性炎症性疾病。进入21 世纪，UC 已经发展为全球性疾病，患病率逐年升高，给社会造成巨大的经济负担，是现代医疗卫生系统的一大挑战[1]。为了改善疾病的自然病程并尽可能保留肠道功能、改善预后，对UC 治疗目标的选择也从临床缓解转为内镜缓解[2]。但仍有相当部分实现内镜缓解的患者结肠组织中存在组织学活动的表现，进一步追求组织学缓解有利于改善患者的长期预后[2-4]。中性粒细胞（neutrophils，NEU）浸润是UC 的重要组织学微观特征，实现黏膜无NEU 浸润与疾病复发率降低相关[5]。NEU 在UC 发生、发展中起关键作用，其在内镜活检下的组织病理活动状态以及NEU 相关生物标志物在UC 的诊断、评估疾病活动性、预测临床预后中有重要参考价值。本文就NEU 在UC 发病中的作用机制及其临床应用的研究进展作一综述。

1 NEU 在UC 发病机制中的作用

NEU 在机体固有免疫功能中发挥重要作用，但其功能的“过度激活”可诱发多种自身免疫性疾病[6-7]。NEU成熟的过程中会有3种不同类型的蛋白颗粒形成：原发性颗粒，包括髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）等；继发性颗粒，包括胶原酶等；三级颗粒，包括基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等[6]。UC中有大量的NEU浸润肠道黏膜，释放蛋白颗粒及活性氧等成分损伤细胞和组织，导致典型的UC黏膜表现如隐窝炎、黏膜糜烂、溃疡形成[8-9]。

1.1 NEU 释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重肠道炎症 ROS 包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢等，它们能够通过对DNA、蛋白质、脂质等各种细胞成分的氧化作用来诱导细胞的死亡，造成组织损伤和炎症反应[10]。NEU 在吞噬细菌、颗粒状物质和可溶性刺激物时可产生大量的ROS[9]。肠道黏膜中浸润的NEU 过度分泌的ROS 和机体对ROS 清除能力的不足会导致ROS 在肠道黏膜中的累积[11-12]。ROS可以促发氧化应激反应和激活蛋白水解酶，引起肠道黏膜上皮细胞渗透性升高和肠腔内病原体入侵肠道固有层，加重黏膜炎症和炎症损伤，导致UC 发展过程中的肠黏膜细胞坏死和溃疡形成[9]。

1.2 中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）加重黏膜炎症并促进血栓形成 NETs 是NEU 膜上外突的网状结构，包括解浓缩的染色质、DNA 和抗菌肽，在NEU 抗微生物功能中发挥重要作用[13-14]。NETs 在UC 患者中的表达水平高于健康人群，这提示两者之间存在着潜在的病理联系[15]。NEU 能够被多种因素刺激产生过度表达的NETs，如炎症细胞因子、一氧化氮、各种自身抗体以及NEU 和血小板的相互作用等[13]。过表达的NETs 能够分泌IL-1β、TNF-α等，放大炎症级联反应，是UC 患者肠道黏膜免疫炎症反应失调的重要促发因素[13]。Angelidou 等[16]的研究表明REDD1/autophagy/NETs/IL-1β 信号转导通路的激活，产生的IL-1β 参与介导UC 的肠道炎症和黏膜损伤。此外，UC 是深静脉血栓和肺栓塞事件已知的危险因素[17]。UC 患者的结肠组织及外周血中存在的NETs是活化组织因子（tissue factor，TF）的主要来源[16]。活化TF 的分泌主要由炎症微环境来调控，并在UC 相关的血栓形成（如肠多灶性梗死）过程中起重要作用[16]。

1.3 NE 加重组织损伤并影响生物制剂疗效 NE 是一种丝氨酸蛋白酶，发现于NEU 的原始颗粒[18]。UC 患者肠道黏膜组织中的NE 在mRNA 和蛋白水平上的表达均高于健康人群[18]。NEU 能释放大量的NE、蛋白酶-3 和组织蛋白酶G，其中NE 能够水解细胞外基质的重要成分——弹性蛋白[19]。这些NEU 颗粒蛋白酶能够杀伤被吞噬的病原体，但其过量释放会导致组织的损伤，并抑制慢性炎症性疾病中机体对凋亡细胞的清除[19]。肠道蛋白酶和抗蛋白酶平衡的失调是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的重要发病机制。研究表明UC患者肠道黏膜中的NE和弹性蛋白酶抑制物Elafin 均表达增高[19]。但表达增高的Elafin 仍不足以弥补大量释放的NE导致的弹性蛋白过度水解[19]。丝氨酸蛋白酶抑制剂B1，是最有效的内源性NE 抑制物之一，能够抑制由H2O2诱导的胞内NE 活性表达[20]。丝氨酸蛋白酶抑制剂B1 的相关作用也被认为是UC 疾病中肠上皮细胞保护的重要机制之一[20]。英夫利昔单抗（TNF-α 单克隆抗体）是用于治疗UC 的第一种生物制剂，主要用于治疗中重度UC，已被证明能够显著改善患者的临床症状和诱导黏膜愈合[21]。NE 对英夫利昔单抗的水解作用，破坏了英夫利昔单抗中和TNF 的能力。这也能解释临床上部分患者对英夫利昔单抗治疗表现为无反应或反应微弱，达不到目标疗效[19]。

1.4 MMPs 损伤肠道黏膜屏障 MMPs 是一类结构相似的锌依赖蛋白酶，参与细胞外基质的降解和重塑，其表达水平的增加与免疫介导的组织损伤相关[22-23]。在UC发病机制中，MMPs 通过损伤基底膜，改变肠道屏障的通透性，激活和招募促炎细胞因子，抑制上皮细胞再生，调节血管生成等途径发挥关键作用[22，24]。MMP-9是参与UC发生、发展的主要MMPs[23]，随着NEU大量浸润肠道黏膜，MMP-9 由NEU 脱颗粒释放向炎症微环境[22，25-26]。MMP-9 可破坏肠道黏膜细胞间紧密连接，使得肠道黏膜通透性增高，加重黏膜屏障功能的损害[27]。

1.5 细胞因子与NEU 相互作用促发UC 炎症活动NEU 在活动性UC 的固有层免疫细胞中占据优势地位，常常是造成黏膜损伤的主要效应细胞[28]。NEU 和细胞因子相互作用在UC 发病机制中有重要作用。在UC 中，IL-1β 主要由存在于血液循环以及炎症肠道局部的NEU等免疫细胞产生，导致组织损伤及炎症。IL-1β的产生途径主要有中性粒细胞丝氨酸蛋白酶途径和炎症小体依赖的半胱天冬酶-1 途径[28]。因此，阻断中性粒细胞丝氨酸蛋白酶和半胱天冬酶-1可能是未来治疗UC 的一项治疗策略[28]。Stakenborg 等[29]研究发现NEU通过“肝细胞生长因子-肝细胞生长因子受体酪氨酸激酶”信号转导通路表达促炎细胞因子IL-1β 和TNF-α，促进幼稚T 淋巴细胞向Th17分化，诱导肠道黏膜的炎症反应。抗原特异性中性粒细胞在促发UC炎症活动中有重要作用：NEU暴露在抗原环境中，随后特异性抗原与致敏的NEU 表面形成的“Fcγ 受体Ⅰ/特异性免疫球蛋白G复合体”结合，刺激NEU释放TNF-α等促炎细胞因子，从而引起UC的炎症活动和病情复发[30]。

1.6 NEU 在UC 中的保护性作用 目前认为NEU 在肠道损伤修复中具有促炎症和保护性双重作用[31]。NEU通过吞噬作用、释放NETs、抗菌肽、ROS 等抵御入侵受损肠道的微生物；同时可通过释放促修复因子、趋化因子、生长因子等促进肠道屏障的恢复，有助于黏膜愈合[31]。也有研究发现部分NEU 群体在UC 中发挥着保护性作用。CD177+NEU 亚群被发现能够比CD177-NEU 释放更高水平的ROS 和抗菌肽来提高肠道防御能力，而表达较低水平的促炎细胞因子[32]。同时CD177+NEU 高表达IL-22 有助于维护肠道上皮的完整性[32]。Leppkes 等[33]发现在UC 糜烂出血病灶处，浸润的NEU 通过肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptidylarginine deiminase type 4，PAD4）介导形成的NETs 重塑血液凝块为免疫血栓，这些免疫血栓的形成有助于减少肠道出血，促进伤口愈合。

2 NEU在UC中的临床应用

2.1 NEU 在预测UC 临床预后中的应用 临床上广泛将临床缓解和内镜缓解作为UC 患者的治疗目标，以改善患者的临床预后[34]。但越来越多的研究表明组织病理学层面的缓解更能代表UC 患者的良好预后，让患者获得更长的临床缓解期，减少疾病的复发率和加重率[3，34-36]。将组织学缓解作为评估病情的优选指标能更有效地反应疾病活动性、治疗应答，预测临床预后[5]。UC 的组织学特征包括结肠基底浆细胞增多、NEU 浸润、嗜酸性粒细胞增多、黏蛋白耗竭以及隐窝结构异常，其中NEU 浸润是影响UC 临床复发最重要的危险因素[4]。此外，上皮层NEU 浸润的改善往往是治疗应答上最先出现的指标变化，对于预测1 年后的内镜缓解和内镜下黏膜组织学缓解的准确度最高[37]。建议在临床治疗实践中，将上皮层NEU 浸润的改善作为治疗目标之一[38]。

上皮层或固有层NEU 浸润是公认的UC 疾病活动的标志[36，39]。相关研究常常将NEU 相关指标作为组织学缓解定义标准的重要部分，如上皮层缺乏NEU，固有层缺乏NEU，无隐窝脓肿。上皮层缺乏NEU 浸润和无隐窝脓肿与改善的临床预后相关，包括更低的复发率和更小的结直肠病变累及范围[3]。相对于发现组织中NEU 活动的患者，未发现NEU 活动患者的复发相对风险降低了60%～70%[36]。在一项前瞻性研究队列中，以NEU 相关炎症为特征的组织学活动是患者3 年随访期内需要使用皮质类固醇激素来控制症状的唯一独立预测因素[35]。该前瞻性队列研究表明达到NEU 相关的完全组织学缓解对UC的良好预后具有重要价值[35]。

2.2 NEU 相关标志物在UC 的临床预后、活动性评估中的应用

2.2.1 粪便标志物 钙卫蛋白，主要来源于NEU，富含于NEU 胞质[40]。鉴于内镜检查给患者带来的不适感和并发症风险，粪便钙卫蛋白（fecal calprotectin，FC）作为一个非侵入性的IBD 肠道黏膜炎症标志物，有助于评估疾病活动性、黏膜愈合情况、疾病复发风险[40]。Magro 等[39]研究表明基于FC 的检测能够反映UC 患者是否处于组织学缓解状态，从而减少一部分患者对于内镜检查的需求。对于无症状UC 患者，FC 和粪便中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白也能够有效评估患者的疾病活动性[41]。而在低级别肠道炎症状态下，粪便中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在监测疾病活动性上可能比FC 更具备潜在优势[42]。

2.2.2 血清标志物 考虑到粪便样本获取及加工处理的不便性，中性粒细胞淋巴细胞比值通过简单的血常规细胞计数的运算即可获得。其能够反映UC 疾病活动性，并且能够作为患者接受抗TNF 药物治疗后达到临床缓解和黏膜愈合的早期预测因子[43]。此外，de Bruyn 等[44]研究发现血清NEU 相关标志物（NEU 计数、壳多糖酶3 样蛋白1、LL-37）联合CRP 能够准确监测UC 患者接受抗TNF 药物治疗后的黏膜愈合情况。CPa9-HNE，是Mortensen 等[45]新发现的经NE 降解后的血清钙卫蛋白新抗原表位片段，研究表明其能够准确监测IBD NEU 活性和疾病活动性，且有望成为能够预测IBD 患者达到黏膜愈合的潜在生物标志物。

2.3 NEU 作为UC 的治疗靶点

2.3.1 抑制NEU 释放ROS 橙皮苷甲基查尔酮（hesperidin methyl chalcone，HMC）是一种柑橘生物类黄酮，具有抗炎、镇痛、抗氧化的特性，能够通过增加结肠的抗氧化能力和谷胱甘肽水平来降低氧化应激的发生，减少肠道黏膜NEU 的浸润以及黏膜炎症损伤[11]。橙花叔醇（nerolidol，NRD），一种天然存在的具有膳食生物活性的脂肪族倍半萜醇[46]。MPO 主要存在于NEU的原发性颗粒中，常常作为衡量NEU 浸润程度的指标之一[46]。NRD 处理能够显著降低MPO 活性，减少NEU浸润，抑制促炎细胞因子的分泌，缓解UC 的结肠炎症[46]。NRD 还可通过上调组织中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的水平来减少ROS 和脂质过氧化物的生成，同时上调体内重要的还原剂谷胱甘肽的含量[46]。环孢素A（cyclosporine A，CsA）是钙调神经磷酸酶抑制剂之一，作为临床上治疗严重难治性UC 的诱导剂使用。研究发现CsA 可以通过“沉默信息调节因子6/缺氧诱导因子-1α”依赖的糖酵解途径来抑制NEU 释放ROS、MPO 和抗菌肽，从而抑制NEU 的迁移能力和凋亡，防止肠道黏膜中招募的NEU 的过度激活和炎症暴发[47]。

2.3.2 抑制NETs 的形成及NE 活性 染色体外DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）参与NETs 的形成，而DNA 酶能够有效地水解炎症结肠局部的结肠细胞向细胞微环境释放的ecDNA[48]。因此调节ecDNA 通路相关的治疗策略或许会是一个潜在的治疗UC 的方向，包括对DNA 酶的应用[48]。葡萄球菌核酸酶（staphylococcal nuclease，SNase）是一种非特异性的磷酸二酯酶，具有很强的降解DNA 的能力[49]。研究人员利用交联技术制备了海藻酸钙包裹的SNase——ALG-SNase凝胶微球，凝胶微球可将SNase 成功输送到结肠，随后观察到NETs 被降解，减轻了结肠组织的炎症状态[49]。同时肠道通透性降低，保护了肠道屏障功能，这与闭合蛋白和闭锁小带蛋白1 的表达上调有关[49]。PAD4对组蛋白瓜氨酸化的催化活性在NETs 的形成过程中起着关键作用[50]。阻断这种翻译后的蛋白修饰过程已被证明可以有效治疗UC，如PAD4 抑制剂的使用[48，50]。NE 的蛋白水解特性，破坏了英夫利昔单抗对TNF 的中和作用，降低了英夫利昔单抗的临床应答率。通过添加外源性蛋白酶抑制剂来抑制NE 活性是UC 一种潜在的有效治疗策略，联合外源性蛋白酶抑制剂和生物抗体制剂疗法可以起到相辅相成的效果[19]。

2.3.3 抑制MMP-9 的表达 MMP-9 被认为是治疗UC的新靶点，MMP-9 的表达随着UC 的病情进展而升高，但在UC 得到有效治疗后表达下降[51]。Andecaliximab（GS-5745）是一种完全人源化的高亲和力IgG4 单克隆抗体，能够选择性结合并抑制MMP-9[24]。一项Ⅰ期随机安慰剂对照临床试验表明，Andecaliximab 处理能够通过降低MMP-9 的基因表达和组织表达水平来改善UC 患者的临床、内镜和组织病理预后[24]。但另一项随机双盲安慰剂对照的Ⅱ/Ⅲ期临床试验却发现Andecaliximab 处理组与安慰剂组相比，在临床缓解应答率、内镜缓解应答率和黏膜愈合率上差异均无统计学意义。这可能与Ⅱ/Ⅲ期临床试验的安慰剂组缓解率相对Ⅰ期试验更高，以及Ⅱ/Ⅲ期临床试验相较Ⅰ期试验包含更多的难治患者有关[22]。而de Bruyn 等[52]的研究表明MMP-9 的药理抑制并未改善IBD 的结肠炎症，认为MMP-9 表达的上调是肠道炎症的结果而非炎症的致病病因。可见有关MMP-9 的药理抑制在UC 治疗中的作用仍有争论，需要更深入的研究加以验证。

2.3.4 抑制NEU 释放促炎细胞因子 熊果酸（ursolic acid，UA）是一种从薰衣草、苹果皮等药用植物及水果中提取纯化而来的天然五环三萜羧酸[53]。UA处理能够减轻UC黏膜上皮内NEU炎性浸润，同时能够下调血清和结肠组织中IL-6 水平[53]。SM934 是一种新型的水溶性青蒿素类似物，据报道其在免疫抑制方面表现出良好的潜力[54]。SM934 处理后MPO 活性显著降低，同时结肠组织中浸润的巨噬细胞和NEU 数量显著减少，引起促炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达的减少，减轻UC 的肠道炎症损伤[54]。肽聚糖识别蛋白1（peptidoglycan recognition protein 1，PGLYRP-1）与髓样细胞触发受体1（triggering receptor expressed on myeloid cells 1，TREM-1）相结合能够刺激NEU释放TNF-α、IL-β、IL-6和MPO，而抗TREM-1 抗体能够阻断这些促炎症因子释放的过程[55]。这个抑制效应被证实在NEU 高度浸润和PGLYRP-1高表达的UC患者人群中表现更显著[55]。

3 小结和展望

NEU 在UC 中的病理作用主要与ROS、NETs、NE、MMPs 以及一些促炎细胞因子的释放有关。它们造成肠道组织黏膜的损伤，促发并加重肠道黏膜炎症，形成糜烂、溃疡和出血。以这些蛋白酶和细胞因子为靶点的治疗效应在一些动物和临床研究中得到了初步验证。但目前以NEU作为药理靶点的治疗策略尚缺乏高质量的临床研究来证实其在UC中的疗效和安全性。

NEU 在UC 发病中同时起着促进炎症发展和肠道保护作用，这一看似矛盾的表现可能是不同功能NEU群体的作用以及下游效应分子功能多样化的原因。进一步研究以完善阐述NEU 在UC 中的作用机制网络是必要的。这些新发现提示在临床上采取靶向NEU的治疗手段时，考虑到平衡NEU 的促炎症和保护性作用对于提高疗效有着重要意义。

上皮层NEU 活动状态是评估UC 组织学炎症的最佳指标[36]。有研究提倡将NEU 相关的组织学缓解作为UC的治疗目标以改善患者的长期临床预后[35]。但目前尚缺乏NEU 相关的组织学缓解的统一定义，这为开展相关临床试验、对比研究数据，乃至应用于临床诊疗实践带来困难。此外，NEU 相关生物标志物在各项研究中灵敏度和特异度检测结果存在异质性，缺乏统一的检测阈值。尚需更新检测技术和统计分析算法，推动更大规模、高质量的研究进一步筛选出能够满足UC特异性要求的理想生物标志物及其相应的标准检测流程和检测阈值。未来应推动高质量的多中心随机对照临床试验开展NEU 在UC 诊断、疗效评估、预后评估等方面的研究，以利于进一步优化UC的临床诊疗实践。