慢性牙周炎患者龈沟液MIF、β-catenin表达与疾病严重程度的关系

徐频频 闫俊杰 陈勇 付海标

慢性牙周炎是指由细菌引起的一种慢性感染性疾病，主要表现为牙周组织附着丧失和牙槽骨吸收破坏，患者早期多无明显症状，随着炎症进一步加重，逐渐出现牙周溢脓、牙齿松动等临床表现，最终可导致牙齿脱落、牙列丢失[1]。研究认为，慢性牙周炎会增加患者发生心脑血管疾病的风险，慢性牙周炎患者早期诊断和病情评估有重要意义[2]。临床通过抗生素治疗和手术能够降低牙周组织破坏程度，但难以完全清除病原菌。因此，明确牙周炎发病的分子机制对指导治疗有积极意义。多种细胞因子参与牙周炎的发生、发展，牙周致病菌通过激活免疫活性细胞，可启动宿主免疫应答，促使炎症因子释放，加重牙周组织损伤。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一种多功能蛋白，是炎症反应的主要调节因子，参与多种炎症疾病的进展。现有研究已在牙周炎患者龈沟液中检测到MIF 表达[3]，但关于其水平高低与牙周炎疾病严重程度的相关报道较少。近年来，Wnt通路中蛋白及抑制因子与牙周炎的相关研究逐渐受到临床关注，β-连环蛋白（β-catenin）是Wnt 信号通路中的关键调控因子，其表达是激活该通路的重要环节，具有介导细胞间黏附和参与基因表达的功能[4]。基于此，本研究探讨慢性牙周炎患者龈沟液MIF、β-catenin 的表达与疾病严重程度的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019 年1 月至2021 年1 月丽水市人民医院口腔科就诊的慢性牙周炎患者80 例，参照《2018 年牙周病和植体周病国际新分类简介》中关于牙周炎严重程度分类标准[5]分为轻中度牙周炎组36例、重度牙周炎组44 例。纳入标准：（1）患者符合《牙周病诊疗指南》[6]中的相关诊断标准；（2）近期未使用过药物治疗口腔疾病者；（3）意识清晰、认知正常者。排除标准：（1）患有恶性肿瘤者；（2）合并高血压、糖尿病、冠心病者；（3）伴有肝、肾功能障碍者。另选取同期来本院口腔科就诊的40 名牙周组织健康者作为对照组。轻中度牙周炎组男23 例，女13 例；年龄20～65（41.14±7.35）岁。重度牙周炎组男27 例，女17 例；年龄20～65（42.21±7.50）岁。对照组男22 名，女18 名；年龄20～65（40.91±7.35）岁。3 组研究对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号：LLW-FO-403）。

1.2 方法 所有研究对象均于治疗前采集龈沟液样本，具体方法：将滤纸条置于牙周袋底停留30 s，获取龈沟液，将滤纸条放入加有1 ml PBS的试管中，3 000 r/min离心5 min，取上清液，-20 ℃环境下保存待检。

1.2.1 龈沟液MIF 表达水平检测 采用ELISA 法检测龈沟液MIF 表达水平，试剂盒为上海康朗生物科技有限公司产品，按照说明书进行操作。

1.2.2 龈沟液β-catenin 表达水平检测 采用TRIzol试剂提取龈沟液总RNA，测定其纯度和浓度，鉴定合格后行逆转录，试剂盒为天根生物有限公司产品，按照说明书进行操作。采用RT-qPCR 法检测龈沟液βcatenin 表达，正向引物：5'-CTCTGAGAAACTTGTCCGATG-3'，反向引物：5'-GTGACCACATTTATATCATCAGAAC-3'。引物由华大基因公司合成，扩增体系：2 μl cDNA、0.4 μl 正向引物、0.4 μl 反向引物、7.2 μl 过氧化氢溶液、10 μl SYBR 荧光染料。反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环。

1.3 观察指标 （1）比较重度牙周炎组、轻中度牙周炎组、对照组龈沟液MIF、β-catenin 表达水平。（2）分析龈沟液MIF、β-catenin 表达水平与慢性牙周炎疾病严重程度的相关性。（3）分析龈沟液MIF、β-catenin 表达水平对慢性牙周炎的诊断价值。

2 结果

2.1 重度牙周炎组、轻中度牙周炎组、对照组龈沟液MIF、β-catenin 表达水平比较 重度牙周炎组、轻中度牙周炎组、对照组龈沟液MIF、β-catenin 表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且重度牙周炎组龈沟液MIF、β-catenin 表达水平＞轻中度牙周炎组＞对照组（均P＜0.05），见表1。

表1 重度牙周炎组、轻中度牙周炎组、对照组龈沟液MIF、β-catenin 表达水平比较

2.2 龈沟液MIF、β-catenin 表达水平与慢性牙周炎疾病严重程度的相关性分析 Spearman 等级相关分析显示，龈沟液MIF、β-catenin 表达水平与慢性牙周炎疾病严重程度均呈正相关（rs=0.744、0.808，均P＜0.05）。

2.3 龈沟液MIF、β-catenin 表达水平对慢性牙周炎的诊断价值分析 ROC 曲线分析显示，龈沟液MIF、βcatenin 表达水平诊断慢性牙周炎的最佳截断值分别为11.930 ng/ml、1.500 g/L，灵敏度均为0.900，特异度分别为0.950、0.990，均有较高的诊断价值（均P＜0.05）。见图1、表2。

表2 龈沟液MIF、β-catenin 表达水平对慢性牙周炎的诊断价值分析

图1 龈沟液MIF、β-catenin表达水平诊断慢性牙周炎的ROC曲线

3 讨论

慢性牙周炎主要由牙菌斑作用在牙面上，对牙周组织进行刺激而形成，主要表现为牙龈炎症、牙周袋形成、附着丧失、牙槽骨松动等[7]。据报道，龈沟液中富含微生物、营养素、血清蛋白、炎症因子、生长因子等，为维持口腔环境提供条件，并参与疾病的发生、发展，因此，检测龈沟液中细胞因子水平对于诊断慢性牙周炎具有重要意义[8]。

慢性牙周炎的发展主要在于致病菌与宿主间的相互作用，多项研究认为，在牙周致病菌及其产物的持续作用下，机体免疫系统受到刺激，无法正常清除病原微生物，造成牙周组织炎症反应持续加强，牙龈上皮细胞释放多种炎症因子，影响牙周组织生长代谢，加重牙周组织损伤程度[9]。MIF 主要表达于T 淋巴细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞中，在先天性免疫反应中发挥重要作用，参与多种炎性疾病的发生、发展，可通过激活下游激酶，活化胞质内蛋白，引发炎症反应[10]。Wnt 通路参与机体骨质代谢、免疫调节等过程，该通路激活后能够促进成骨细胞相关基因表达，在维持牙周稳态中发挥重要作用，研究指出，βcatenin 是激活该通路的重要环节，广泛存在于内皮细胞、成纤维细胞中，参与牙周炎症及免疫反应的调节[11]。孙欣彤等[12]研究发现，β-catenin 在慢性牙周炎患者龈沟液和牙龈组织中表达增加，且水平变化与牙周炎严重程度呈正相关，提示β-catenin 对炎症环境起关键调节作用。庞晓霞等[13]研究发现，慢性牙周炎患者血清MIF 水平高于健康对照组人群，提示慢性牙周炎患者存在严重炎症反应。本研究结果显示，轻中度牙周炎组、重度牙周炎组龈沟液MIF、β-catenin 表达水平均高于对照组，且重度牙周炎组高于轻中度牙周炎组；同时，Spearman 等级相关分析显示，龈沟液MIF、βcatenin 表达水平与慢性牙周炎疾病严重程度均呈正相关。这说明随着疾病进展，慢性牙周炎患者龈沟液MIF、β-catenin 表达水平均升高，该两项指标能够较好地反映慢性牙周炎的疾病严重程度。

此外，本研究结果还显示经ROC 曲线分析，龈沟液MIF、β-catenin 表达水平对慢性牙周炎有较高的诊断价值。笔者分析，MIF 作为一种促炎因子，在机体发生感染、应激、炎症时迅速增高，表现在慢性牙周炎患者中，牙周致病菌可刺激免疫细胞释放多种促炎因子，促使龈沟液MIF表达水平增高，加重病情；Wnt通路可发挥抗炎和促炎的双重作用，一方面，Wnt 通路激活后能够抑制中性粒细胞、巨噬细胞的迁移，进而抑制炎症反应；另一方面，Wnt 通路还参与调节辅助性T 细胞的分化，β-catenin 表达可通过NF-κB 信号通路影响炎症因子释放，炎症反应持续发生，参与慢性牙周炎患者牙槽骨破坏和牙骨质吸收过程，进一步加重病情[14-15]。

综上所述，慢性牙周炎患者龈沟液MIF、β-catenin表达水平均升高，且与疾病严重程度呈正相关。该两项指标可用于评估疾病严重程度，且有较高的诊断价值，或可为治疗方案的选择提供参考。