不同种子处理方法下长枝木霉T6菌株对小油菜促生作用及生理特性的影响

郭彩苹，张 禄，孙晨曦，马耀杰，李昕冉，景 涛，徐秉良，张树武

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

小油菜(BrassicachinensisL.)又名上海青、青梗菜和青菜等[1]，由于其具有口感爽脆、富含维生素、生长周期短及一年四季皆可种植等优点[2]，已成为我国种植面积和范围最广的蔬菜之一[3]。但是近年来小油菜种植模式单一、化学肥料使用种类单一及其过量使用[4]，导致连作障碍、土壤板结和酸化等一系列问题[5]，使得种子发芽率降低，幼苗生长势降低，甚至严重影响小油菜口感和品质。因此，如何提高种子发芽率、幼苗生长势及育苗效率等成为目前种植小油菜急需解决的问题。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一类广泛存在于各个生态系统中的真菌[6]，其不仅具有重要的生防价值，还具有促进植物生长、改善植物生长环境、提高植物产量及其产品质量等功能[7]。贺字典等[8]研究表明，溶磷木霉菌tang-10-11能够将辣椒根际土壤难溶性磷转化成速效性磷，间接促进速效钾和有机质的转化，进而促进了辣椒植株生长，提高辣椒维生素C和可溶性糖含量；张成等[9]发现棘孢木霉DQ-1分生孢子粉能够显著促进黄瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗根系数量增多和茎秆增粗；廉华等[10]发现棘孢木霉菌剂能够提高黄瓜幼苗叶绿素含量、根系活力、可溶性糖及可溶性蛋白等含量，进而提高黄瓜产量和品质；Yu 等[11]发现木霉菌株TaspHu1高浓度孢子悬浮液可以显著提高番茄株高、茎粗、可溶性蛋白和可溶性糖的含量。但是，目前有关采用水琼脂培养法、种子浸泡法和盆栽灌根法处理测定长枝木霉T6菌株对小油菜促生作用及生理特性影响方面的报道较少。

因此，本试验通过种子萌发和幼苗盆栽试验测定了长枝木霉T6菌株孢子悬浮液和发酵滤液对小油菜促生作用及生理特性的影响，分析和讨论长枝木霉T6菌株对小油菜的促生效果及初步作用机制，以期为提高小油菜产量和品质提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株为长枝木霉T6菌株，由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室提供，保藏于中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.13183。

1.1.2 供试品种 小油菜品种为‘德高’，采购于甘肃省农业科学院种子有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 长枝木霉T6菌株分生孢子悬浮液配制 悬浮液参照张树武等[12]方法配制。长枝木霉T6菌株在PDA平板培养6 d后，在其培养基中加入1滴Tween-80和5 mL无菌水配制成分生孢子悬浮液，并将其转移到无菌离心管中，经振荡充分混匀后，利用血球计数板计算其浓度，最终配制浓度为1.0×107cfu·mL-1孢子悬浮液备用。

1.2.2 长枝木霉T6菌株发酵滤液制备 取1 mL浓度为1.0×107cfu·mL-1长枝木霉T6菌株孢子悬浮液加入到70 mL马铃薯葡萄糖液体培养基中，同时取1 mL无菌水加入到70 mL马铃薯葡萄糖液体培养基中作为对照。将两者置于温度为25℃，转速为150 r·min-1的摇床中培养；8 d后，将培养液经8 000 r·min-1离心20 min后吸取上清液，并利用双层滤膜过滤，加入悬浮液处理获得的滤液即为长枝木霉T6菌株发酵滤液。每个处理和对照均重复6次。

1.2.3 长枝木霉T6菌株及其孢子悬浮液对小油菜种子活性及幼苗生长的影响 水琼脂培养法：挑选饱满健康的小油菜种子，利用75%酒精浸泡消毒2 min后，经无菌水充分冲洗3次，用无菌吸水纸吸取多余水分后备用。将其种植于水琼脂培养基一侧1/3处(d=8.5 cm)，并在其对应的另一侧1/3处接种直径为0.5 cm长枝木霉T6菌株菌饼和空白水琼脂菌饼分别作为处理和对照。待接种后，将其分别置于25℃培养箱中光暗交替培养(16 h/8 h)。每个培养基中种植5粒小油菜种子，每个处理和对照均重复6次。

浸泡法：将消毒后的种子分别置于浓度为1.0×107cfu·mL-1长枝木霉T6孢子悬浮液和无菌水中浸泡2 h，分别作为处理和对照。然后，分别将处理和对照组种子置于含有一层纱布和两层滤纸的无菌培养皿(d=8.5 cm)中，并置于25℃培养箱中光暗交替培养(16 h/8 h)。每个培养皿中种植5粒小油菜种子，每个处理和对照均重复6次。

待小油菜种子胚根长度超过种子长度一半时开始统计发芽率和发芽指数，待处理7 d后测定幼苗胚根和胚芽长度及干、鲜重，并利用根系扫描仪(WinRHIZO pro LA2400)测定根系总投影面积、总根表面积、平均根系直径、总根体积和根尖数。每个处理和对照均重复6次。

发芽率(%)=(发芽种子总数/供试种子总数)×100

发芽指数=∑Gt/Dt

式中，Gt为t时间内发芽数,Dt为相应发芽天数。

1.2.4 长枝木霉T6菌株发酵滤液对小油菜幼苗生理特性的影响 将饱满、健康且经消毒的小油菜种子种植于含有营养土的育苗盘中(32穴)，每穴种植5粒。种植10 d后，取20 mL长枝木霉T6菌株发酵滤液浇灌于小油菜根系周围土壤中，对照则浇灌等体积马铃薯葡萄糖滤液，每个处理和对照均重复6次。然后，将其置于温室中培养(培养温度25℃，相对湿度RH>60%和光照16 h/8 h)，每隔2 d浇一次水，并在处理30 d后分别测定小油菜幼苗叶绿素和可溶性蛋白含量。参考陈毓荃[13]方法，采用分光光度法测定小油菜幼苗叶绿素含量；参考杨玉芳[14]和邱葵等[15]方法，采用考马斯亮蓝G-250法测定小油菜幼苗可溶性蛋白含量。每个处理及对照均重复3次。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件和SPSS 21.0软件整理分析数据，采用Duncan’s新复极差法对各处理进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 水琼脂培养下长枝木霉T6菌株对小油菜种子活性的影响

在水琼脂培养基上，长枝木霉T6菌株对小油菜种子活性具有显著的影响 (图1，表1)。经长枝木霉T6菌株处理的小油菜种子发芽整齐，幼苗生长发育良好，胚根长且粗壮(图1B)，而对照生长势相对较弱，胚根较短(图1A)。与对照相比，长枝木霉T6菌株处理后的小油菜种子发芽率、发芽指数、幼苗胚根长度、胚芽长度、鲜重和干重的相对增长率分别为2.51%、20.55%、70.79%、21.98%、32.00%和30.00%(表1)。

注：A：对照；B：长枝木霉T6菌株处理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 strain treatment.图1 长枝木霉T6菌株对小油菜幼苗生长的影响Fig.1 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the seedling of Brassica chinensis growth

表1 长枝木霉T6菌株对小油菜种子活性及幼苗形态特征的影响Table 1 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the seed vigor and seedlings morphological characteristics of Brassica chinensis

2.2 水琼脂培养下长枝木霉T6菌株对小油菜根系发育的影响

与对照相比，长枝木霉T6菌株能够显著促进小油菜根系生长发育(图2，表2)。经长枝木霉T6菌株处理的小油菜胚根发育良好，侧根数量多且发达(图2B)，而对照侧根数量相对较少(图2A)。长枝木霉T6菌株处理的幼苗根系总投影面积、总根表面积、平均根系直径、总根体积和根尖数显著高于对照，分别较对照增加58.49%、58.79%、18.18%、100.00%和77.88%(表2)。

注：A：对照；B：长枝木霉T6菌株处理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 strain treatment.图2 长枝木霉T6菌株对小油菜根系生长发育的影响Fig.2 Effects of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the root growth and development of Brassica chinensis

表2 长枝木霉T6菌株对小油菜单株根系生长发育的影响Table 2 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the root growth and development of Brassica chinensis

2.3 浸泡处理下长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对小油菜种子活性的影响

经长枝木霉T6菌株孢子悬浮液浸泡处理的小油菜种子发芽速率和幼苗生长速率显著增加，并且处理后其幼苗生长健壮，胚芽和胚根长且粗壮(图3B)，而对照生长势相对较弱，根系较短且侧根较少(图3A)。与对照相比，经长枝木霉T6菌株孢子悬浮液浸泡处理的种子发芽率、发芽指数、幼苗胚根长度、胚芽长度、鲜重和干重的相对增长率分别为2.06%、19.60%、82.21%、43.36%、31.58%和40.00%(表3)。

注：A：对照；B：长枝木霉T6菌株孢子悬浮液处理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 spore suspension treatment. 图3 长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对小油菜幼苗生长的影响Fig.3 Effect of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the seedling of Brassica chinensis growth

表3 长枝木霉T6孢子悬浮液对小油菜种子活性及幼苗形态特征的影响Table 3 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the seed vigor and seedlings morphological characteristics of Brassica chinensis

2.4 浸泡处理下长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对小油菜根系发育的影响

与对照相比，经长枝木霉T6菌株孢子悬浮液浸泡处理的小油菜胚根发育良好，侧根数量多且发达(图4B)，而对照侧根数量相对较少且较短(图4A)。长枝木霉T6菌株孢子悬浮液浸泡处理后，小油菜根系总投影面积、总根表面积、平均根系直径、总根体积和根尖数较对照分别增加44.19%、45.52%、13.04%、100.00%和28.57%(表4)。

注：A：对照；B：长枝木霉T6菌株孢子悬浮液处理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 spore suspension treatment.图4 长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对小油菜根系生长发育的影响Fig.4 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the root growth and development of Brassica chinensis

表4 长枝木霉T6孢子悬浮液对小油菜单株根系生长发育的影响Table 4 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the root growth and development of Brassica chinensis

2.5 长枝木霉T6菌株发酵滤液对小油菜幼苗叶绿素和可溶性蛋白质含量的影响

结果表明，长枝木霉T6菌株发酵滤液对小油菜幼苗叶绿素和可溶性蛋白含量具有显著的影响。

经长枝木霉T6菌株发酵滤液处理30 d后，小油菜幼苗叶绿素和可溶性蛋白含量均显著增加，与对照相比，其叶绿素和可溶性蛋白含量的相对增长率分别为31.95%和11.40%(表5)。

表5 长枝木霉T6菌株发酵滤液对小油菜幼苗叶绿素和可溶性蛋白含量的影响Table 5 Effects of Trichoderma longibrachiatum T6 fermentation filtrate on the chlorophyll and soluble protein content of Brassica chinensis seedlings

3 讨论与结论

前人关于利用木霉菌促进植物生长方面的相关研究，主要集中在利用其提高植物种子发芽率、幼苗形态特性、根系生长发育及幼苗生理生化酶活性等，如Zhao等[16]研究发现棘孢木霉Q1能增加黄瓜根系活性进而促进根系生长；Elkelish等[17]发现哈茨木霉能通过增强番茄叶绿素的合成和必需营养元素(氮、磷和钾)的吸收，促进其生长；Martinez-Medina等[18]研究发现木霉菌通过调控激素水平来促进甜瓜幼苗的生长。本试验通过不同种子处理方法下测定长枝木霉T6菌株对小油菜促生作用及生理特性的影响，发现长枝木霉T6菌株及其孢子悬浮液能够显著提高小油菜种子的活性，改善幼苗根系生长发育状况。吴利民等[19]利用不同稀释倍数木霉发酵液浸泡番茄种子10 d后，发现处理后番茄种子发芽率及植株生长速度显著提高；刘连妹等[20]研究发现哈茨木霉处理后番茄幼苗的株高和根长均较对照增加，与本试验结果基本一致。此外，本试验发现长枝木霉T6菌孢子悬浮液对小油菜幼苗根系干重、胚芽长度和胚根长度促生作用优于水琼脂培养法。

另外，有研究表明叶绿素和可溶性蛋白含量与植物幼苗的生长发育密切相关，并且可溶性蛋白可为植物种子萌发提供营养元素，是衡量种子活性的重要指标之一[21]。本试验发现长枝木霉T6菌株发酵滤液可显著提高小油菜幼苗叶绿素和可溶性蛋白含量。张树武等[22]发现不同稀释倍数深绿木霉发酵液均能够提高黑麦草幼苗叶绿素、可溶性蛋白含量和与抗性相关酶的活性，进而促进其生长；王依纯等[23]发现3种木霉(棘孢木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉)对黄瓜幼苗叶绿素含量、根系活力和根系总吸收面积等具有显著提高作用。

因此，本试验发现2种处理方法(水琼脂培养法和种子浸泡法)下长枝木霉T6菌株及其孢子悬浮液对小油菜种子活性和根系生长发育具有较强的促生作用，并且其发酵滤液对小油菜叶绿素和可溶性蛋白质含量具有显著提高作用，但是有关不同处理方法下长枝木霉T6菌株对小油菜促生作用机制还有待进一步深入研究。