LINC00657对结直肠癌细胞恶性行为影响及机制

张生军 赵阿静 张安瑞 李雅微 李小宝 刘敏丽

［摘要］ 目的

探討长链非编码RNA（lncRNA）LINC00657通过调控miR-26b及其靶基因黏膜相关组织淋巴瘤异位基因1（MALT1）对结直肠癌（CRC）细胞增殖、侵袭和迁移的影响。

方法 用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测正常肠上皮细胞（NCM460）、CRC细胞系（HT29、HCT116和SW620）中LINC00657的表达水平。对HT29细胞转染shRNA-LINC00657或shRNA-CON，分析沉默LINC00657对癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。用双荧光素酶报告基因验证LINC00657、miR-26b和MALT1的靶向作用关系。对HT29细胞分别仅转染shRNA-LINC00657、同时转染shRNA-LINC00657+miR-26b inhibitor、同时转染shRNA-LINC00657+pcDNA-MALT1，分析LINC00657通过miR-26b/MALT1轴对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，通过Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。应用RT-PCR检测MALT1 mRNA表达水平，Western blot检测MALT1蛋白的表达水平。

结果 CRC细胞系（HT29、HCT116和SW620）的LINC00657表达水平均高于正常肠上皮细胞（NCM460），差异有统计学意义（F=30.267，P<0.05）。沉默LINC00657可以抑制HT29细胞的增殖、侵袭和迁移（t=9.123～18.456，P<0.05）。双荧光素酶报告基因检测证实，LINC00657靶向作用于miR-26b并下调其表达，miR-26b可负调控MALT1的表达。沉默LINC00657表达可抑制HT29细胞中MALT1 mRNA和蛋白的表达水平（F=15.893、17.231，P<0.05）。转染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或shRNA-LINC00657+MALT1过表达载体以后，MALT1 mRNA和蛋白的表达水平较仅转染shRNA-LINC00657明显上调（F=15.893、17.231，P<0.05），细胞增殖、侵袭和迁移能力也升高（F=4.783～8.893，P<0.05）。

结论 LINC00657在CRC细胞中高表达，可通过调控miR-26b/MALT1轴促进癌细胞增殖、侵袭以及迁移。

［关键词］ 结直肠肿瘤；RNA，长链非编码；黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤易位1蛋白；细胞增殖；肿瘤浸润

［中图分类号］ R735.34;R342.2

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096-5532（2023）06-0860-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.203

［网络出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.004;2024-01-05 20：10：18

EFFECTS OF LINC00657 ON MALIGNANT BEHAVIOR OF COLORECTAL CANCER CELLS AND UNDERLYING MECHANISMS

ZHANG Shengjun， ZHAO Ajing， ZHANG Anrui， LI Yawei， LI Xiaobao， LIU Minli

（Department of General Surgury， The Affiliated Hospital of Yan′an University， Yan ′an 716000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of long non-coding RNA （LINC00657） on the proliferation， invasion， and migration of colorectal cancer （CRC） cells by regulating miR-26b and its target gene mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1 （MALT1）.

MethodsReverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to mea-

sure the expression of LINC00657 in normal intestinal epithelial cells （NCM460） and CRC cell lines （HT29， HCT116， and SW620）. HT29 cells were transfected with shRNA-LIC00657 or shRNA-CON to analyze the effects of silencing LINC00657 on the proliferation， invasion， and migration of cancer cells. The targeted relationship between LINC00657， miR-26b， and MALT1 was verified by dual-luciferase reporter assay. HT29 cells were separately transfected with shRNA-LINC00657 alone， shRNA-

LINC00657+miR-26b inhibitor， and shRNA-LINC00657+pcDNA-MALT1 to analyze the effects of LINC00657 on cell proliferation， invasion， and migration through the miR-26b/MALT1 axis. Cell proliferation was determined using Cell Counting Kit-8. Cell invasion and migration was determined using Transwell assay. The expression level of MALT1 mRNA was measured by RT-PCR. The expression level of MALT1 protein was measured by Western blot.

ResultsThe expression levels of LINC00657 in CRC cell lines （HT29， HCT116， and SW620） were significantly higher than that in normal intestinal epithelial cells （NCM460） （F=30.267，P<0.05）. Silencing LINC00657 significantly inhibited the proliferation， invasion， and migration of HT29 cells （t=9.123-18.456，P<0.05）. The dual-luciferase reporter assay showed that LINC00657 targeted miR-26b to downregulate its expression， and miR-26b negatively regulated the expression of MALT1. Silencing LINC00657 expression significantly inhibited the expression of MALT1 mRNA and protein in HT29 cells （F=15.893，17.231，P<0.05）. Compared with those transfected with

shRNA-LINC00657 alone， the cells transfected with shRNA-

LINC00657+miR-26b inhibitor or shRNA-LINC00657+MALT1 overexpression vector had significantly up-regulated expression of MALT1 mRNA and protein （F=15.893，17.231，P<0.05） and significantly increased abilities of cell proliferation， invasion， and migration （F=4.783-8.893，P<0.05）.

ConclusionLINC00657 is highly expressed in CRC cells， which can promote the proliferation， invasion， and migration of cancer cells by regulating the miR-26b/MALT1 axis.

［KEY WORDS］colorectal neoplasms; RNA， long noncoding; mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation 1 protein; cell proliferation; neoplasm invasiveness

结直肠癌（CRC）是消化道常见恶性肿瘤之一，其发病率和病死率呈逐年上升之势［1］。我国CRC新发人数占所有新发恶性肿瘤的9.9%［2］。CRC发病机制尚未完全阐明，因此，进一步探索CRC的发病机制，对寻找其治疗靶点有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200个核苷酸的RNA，在表观遗传调控等方面起到重要作用，在人体各个组织中均有表达［3］。研究发现，lncRNA与细胞增殖、分化、细胞周期、凋亡和自噬等密切相关，参与肿瘤发生发展［3］。lncRNA有望成为CRC在内的多种恶性肿瘤的生物标志物。 LINC00657是近年来发现的一种lncRNA，在CRC细胞系和组织中高表达，过表达LINC00657可促进CRC细胞增殖和侵袭［4］。血清LINC00657高表达与CRC病人不良生存预后有关［5］。lncRNA可作为一种竞争性内源性RNA与微小RNA（microRNA，简称miRNA）相互作用，进而调控信使RNA（mRNA）的表达。微小RNA-26b（miR-26b）在多种癌症中发挥抑癌基因作用［6-7］，过表达miR-26b可以抑制CRC细胞的增殖和侵袭［8］。黏膜相关组织淋巴瘤异位基因1（MALT1）是miR-26b下游基因，miR-26b可负调控MALT1的表达进而抑制肿瘤进展［9］。本文分析LINC00657靶向調控miR-26b/MALT1对CRC细胞增殖、侵袭以及迁移的影响，为LINC00657在CRC中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

正常肠上皮细胞（NCM460）以及CRC细胞系（HT29、HCT116和SW620）购于中国科学院上海细胞库。将细胞培养于含胎牛血清的改良Eagle培养液（DMEM）中，并加入10 g/L青霉素-链霉素，培养条件为37 ℃、体积分数0.05的CO2。细胞融合度达80%～90%时进行传代。

shRNA-LINC00657、miR-26b inhibitor、miR-26b mimics、携带有MALT1基因的过表达重组载体pcDNA-MALT1均购于上海吉玛制药技术有限公司。胎牛血清、DMEM培养基、CCK-8试剂盒、Transwell小室均购于上海炎怡生物科技有限公司。Lipofect AMINETM 2000试剂盒、反转录试剂盒和PCR试剂盒、凝胶快速制备试剂盒均购于日本宝生物工程株式会社。兔抗人MALT1多克隆抗体、GAPDH抗体均购于美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同细胞LINC00657相对表达量检测 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测正常肠上皮细胞（NCM460，a组）、CRC细胞系（HT29，b组；HCT116，c组；SW620，d组）的LINC00657表达水平。用TRIzol法提取细胞RNA，随后反转录得到cDNA，反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、15 s。以cDNA为模板，PCR反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s，72 ℃，20 s。LINC00657引物及其序列见表1。用2－△△Ct法计算LINC00657相对表达量。

1.2.2 沉默LINC00657对HT29细胞增殖、侵袭和迁移的影响 将细胞分为shRNA-CON组（转染shRNA-CON，a组）和shRNA-LINC00657组（转染shRNA-LINC00657，b组），并严格按照Lipofect AMINETM 2000試剂盒步骤进行细胞转染。采用1.2.1的RT-PCR方法检测两组细胞的LINC00657表达水平。采用CCK-8检测细胞增殖：严格按照CCK-8试剂盒说明进行操作，取对数生长期细胞，以每孔1×104个细胞密度接种于96孔板；待细胞贴壁后，分别于培养24、48、72、96 h时加入10 μL的CCK-8溶

液；用酶标仪检测光密度（OD）值，反映细胞增殖能力；实验重复4次。采用Transwell实验检测细胞侵袭和迁移：严格按照Transwell试剂盒的说明书进行操作。迁移实验：将细胞密度调整为1.5×108/L，取200 μL细胞悬液加入Transwell上室；向下室中加入600 μL培养液，培养2 h后弃去培养液，用棉签擦去上室中未迁移细胞，加入甲醇固定10 min；随后用1 g/L结晶紫染色15 min，显微镜下（放大40倍）观察细胞形态并计数细胞。

侵袭实验：用细胞培养液将基质胶（Matrigel）稀释15倍，随后加入Transwell上室，37 ℃培养4 h；后续步骤同迁移实验。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验验证LINC00657、miR-26b和MALT1的作用关系 用StarBase工具预测LINC00657和miR-26b的结合位点，预测miR-26b和MALT1的结合位点。根据预测结果，设计并且合成结合位点的野生型（WT）和突变型（MT）序列。①分别将结合位点的野生型序列（MT-LINC00657）及突变型序列（WT-LINC00657）插入荧光素酶报告基因载体（Pgl3-basic），分别与过表达靶基因质粒（miR-26b mimics）或阴性对照共转染HEK239细胞，分别检测阴性对照组（a组）与LINC00657沉默组（shRNA-LINC00657组，b组）miR-26b表达水平。②分别将结合位点的野生型序列（MT-miR-26b）及突变型序列（WT-miR-26b）插入荧光素酶报告基因载体（Pgl3-basic），分别与过表达靶基因质粒（pcDNA-MALT1）或阴性对照共转染HEK239细胞，分别检测阴性对照组与miR-26b抑制组（miR-26b inhibitor组，c组）MALT1表达水平。最后检测荧光素酶相对活性。

1.2.4 上调miR-26b/MALT1对HT29细胞增殖、侵袭和迁移的影响 ①转染和分组：细胞转染步骤严格按照Lipofect AMINETM 2000试剂盒进行，将细胞随机分为CON组（不转染，a组）、shRNA-LINC00657组（仅转染shRNA-LINC00657，b组）、shRNA-LINC00657+miR-26b inhibitor组（转染shRNA-LINC00657和miR-26b inhibitor，c组）、shRNA-LINC00657+MALT1组（细胞同时转染shRNA-LINC00657和过表达载体pcDNA-MALT1，d组）。②RT-PCR检测MALT1 mRNA表达水平：引物及其序列见表2。③Western blot检测MALT1蛋白表达水平：细胞中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解30 min后离心10 min，应用BCA试剂盒进行蛋白定量。随后加入上样缓冲液，并煮沸5 min，应用SDS-PAGE分离蛋白并将其转移至PVDF膜上，应用50 g/L的脱脂牛奶封闭1 h。加入MALT1抗体（1∶500）以及GAPDH抗体（1∶1 000），孵育过夜。洗膜3次后，加入羊抗兔IgG抗体（1∶5 000，美国Sigma公司），孵育1 h后洗膜3次，最后进行ECL显色。④采用CCK-8检测细胞增殖，采用Transwell 实验检测细胞侵袭和迁移。

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0统计软件处理数据。计量资料以±s形式表示，两组间均数比较用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；重复测量数据采用重复测量方差分析，两两比较用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 CRC细胞系LINC00657表达水平

CRC细胞系（包括HT29、HCT116和SW620）LINC00657表达水平的总体比较，差异有统计学意义（F=30.267，P<0.001）。LSD两两比较结果显示，HT29、HCT116和SW620的LINC00657表达水平均高于正常肠上皮细胞（NCM460），差异有统计学意义（P均<0.05）。见图1。

统计学意义（t=9.123～18.456，P<0.05）。重复测量方差分析显示，随着时间延长两组细胞增殖活力均升高（F时间=10.002，P<0.05），组间总体差异有显著性（F组间=6.897，P<0.05），时间和组间交互作用同样显著（F时间×组间=4.001，P<0.05），LSD两两比较发现细胞培养48、72、96 h时shRNA-CON组细胞增殖活力均高于shRNA-LINC00657组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 LINC00657靶向调控miR-26b介导MALT1的表达

用StarBase工具预测LINC00657和miR-26b的结合位点。见图3A。将WT-LINC00657插入荧光素酶报告基因载体，过表达miR-26b后荧光素酶的活性下降（t=5.674，P<0.05）。见图3B。沉默LINC00657后，miR-26b表达水平升高（t=8.123，P<0.05）。见图3C。以上结果提示，miR-26b是LINC00657的靶基因。用StarBase工具预测miR-26b和MALT1的结合位点见图3D。将WT-miR-26b插入荧光素酶报告基因载体，过表达miR-26b后荧光素酶活性下降（t=7.009，P<0.05）。见图3E。抑制miR-26b后，MALT1表达水平升高（t=11.120，P<0.05）。见图3F。提示MALT1是miR-26b的靶基因。

2.4 上调miR-26b/MALT1對HT29细胞增殖、侵袭、迁移的影响shRNA-LINC00657组、shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor组、shRNA-LINC00657+MALT1组及CON组的MALT1蛋白及基因表达水平、细胞侵袭、细胞迁移的总体比较，差异有统计学意义（F=7.230～17.231，P<0.05）。两两比较显示，与CON组相比，沉默LINC00657表达可以抑制HT29细胞中MALT1 mRNA和蛋白表达水平，差异有显著性（P均<0.05）。转染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者shRNA-LINC00657+MALT1过表达载体后，MALT1 mRNA和蛋白的表达水平较shRNA-LINC00657组明显上调（P<0.05）。见图4A、B。

重复测量方差分析显示，随着时间延长4组细胞增殖活力均升高（F时间=29.897，P<0.05），组间总体比差异有显著性（F组别=4.783，P<0.05），时间和组别的交互作用同样有显著性（F时间×组别=3.897，P<0.05）。两两比较结果显示，与CON组相比较，细胞培养48、72、96 h时沉默LINC00657可明显抑制HT29细胞的增殖（P<0.05）。转染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或shRNA-LINC00657+MALT1过表达载体后，HT29细胞的增殖力较shRNA-LINC00657组高（P<0.05）。见图4C。

与CON组相比较，沉默LINC00657可以显著抑制HT29细胞的侵袭和迁移（P均<0.05）。转染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者shRNA-LINC00657+MALT1过表达载体后，HT29

细胞的侵袭和迁移力较shRNA-LINC00657组高（P均<0.05）。见图5。

3 讨  论

lncRNA作为竞争性内源性RNA与miRNA相互作用，进而调控mRNA表达，在CRC发生发展中发挥重要作用［10］。有研究发现，LINC00657高表达与乳癌［11］和胰腺癌［12］等发生发展有关。本文研究结果显示，CRC细胞系中LINC00657表达水平升高，与既往报道一致［4，13］。另外，沉默LINC00657可以抑制HT29细胞的增殖、侵袭以及迁移，这提示LINC00657参与CRC发生。

LINC00657在肿瘤中的作用机制目前尚未完全明确。已有研究显示，LINC00657高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并抑制凋亡［11，14］。在CRC中，LINC00657高表达可通过促进肝素酶（HPSE）基因转录，促进CRC细胞侵袭和迁移［4］。另外，LINC00657高表达也能通过激活PI3K/AKT通路促进直肠癌细胞的增殖和侵袭［13］。

LINC00657可通过miRNA/mRNA轴促进肿瘤进展，例如，LINC00657高表达通过miR-26b-5p/COMMD8轴促进非小细胞肺癌进展［14］；通过miR-424/PD-L1轴促进肝细胞癌进展［15］。本研究通过生物信息学分析表明，LINC00657和miR-26b有结合位点，miR-26b和MALT1有结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实了miR-26b是LINC00657的靶基因，MALT1是miR-26b的靶基因。已有研究表明，miR-26b参与CRC进展［16］，并且MALT1也是CRC的治疗靶点［17］。为了进一步证实沉默

LINC00657通过上调miR-26b/MALT1对HT29细胞增殖、侵袭、迁移的影响，本文研究对HT29细胞进行转染，结果显示，转染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者转染shRNA-LINC00657+MALT1过表达载体后，细胞增殖、侵袭和迁移能力较仅转染shRNA-LINC00657的细胞高。以上结果提示，LINC00657通过上调miR-26b/MALT1调控CRC细胞行为。

综上所述，LINC00657在CRC细胞中高表达，可通过调控miR-26b/MALT1轴促进癌细胞增殖、侵袭和迁移。LINC00657可能成为CRC治疗靶点。本研究也存在一些局限性，例如未检测CRC组织LINC00657的表达水平及其与病人生存预后的关系。未来需要开展临床和基础研究，进一步探寻LINC00657在CRC中的作用机制。

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（本文編辑 牛兆山）