circ_0072083靶向miR-142-3p调控结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移

李曼 余昌勇 秦鲜 王萍 万新月

结直肠癌(CRC)是在世界范围内普遍存在的恶性肿瘤之一,虽然临床诊断和综合治疗策略的进步延长了CRC患者的生存期,但伴有远端转移CRC患者的预后仍然较差。环状RNA(circRNA)是具有共价闭合的连续环状结构的非编码RNA分子,其具有内源性miRNA海绵功能,并通过抑制miRNA活性、调节其靶基因表达参与调控癌细胞恶性表型,circRNA异常表达参与几乎所有类型癌症进展过程[1]。研究报道非小细胞肺癌组织中circ_0072083水平升高,敲低circ_0072083可提高顺铂对肿瘤细胞的促凋亡、增殖抑制和抗转移作用[2]。然而,circ_0072083在CRC中的生物学功能未见报道。早期研究显示CRC患者血浆、CRC组织中miR-142-3p表达下调[3],上调miR-142-3p通过诱导细胞周期阻滞能够抑制CRC细胞增殖和肿瘤形成[4]。靶基因预测显示miR-142-3p是circ_0072083的潜在靶点,然而circ_0072083能否靶向miR-142-3p调控CRC进展仍需探讨。本研究通过分析CRC组织中circ_0072083、miR-142-3p表达情况,探讨circ_0072083靶向在CRC细胞增殖、转移中的作用,旨在为临床治疗CRC提供有效靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年3月至2019年12月在武汉市江厦区第一人民医院行手术切除52例CRC患者的CRC组织和配对的癌旁组织。其中男30例,女22例;年龄62～76岁。手术切除前均未接受放疗或化疗。样本离体后立即置于液氮冷冻,然后在-80℃下保存。本实验方案获得医院医学伦理委员会批准。所有参与者获得书面知情同意。

1.2 细胞与试剂 CRC细胞LoVo购自中国典型培养物保藏中心;Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司;si-circ_0072083、si-NC、miR-142-3p mimic、miR-NC、anti-miR-NC、miR-142-3p Inhibitor、circ_0072083野生型报告质粒(WT-circ_0072083)、circ_0072083突变型报告质粒(MUT-circ_0072083)购自广州锐博生物公司;CCK-8检测试剂盒、TaqMan multiplex qPCR master mix购自上海翌圣生物;高容量cDNA逆转录试剂盒购自美国ABI公司;Transwell室购自美国Millipore公司;兔源E-cadherin抗体(FNab02617)、兔源N-cadherin抗体(FNab05569)购自武汉菲恩生物公司;羊抗兔IgG(ab205718)和兔源GAPDH抗体(ab70699)购自美国abcam公司。

1.3 RT-qPCR检测circ_0072083和miR-142-3p表达 用TRIzol试剂从临床标本中分离总RNA,用高容量cDNA逆转录试剂盒进行逆转录,用TaqMan multiplex qPCR master mix进行RT-qPCR检测circ_0072083和miR-142-3p表达。用2-ΔΔCt法检测RNA表达倍数的变化。circRNA检测以GAPDH为内参,miRNA检测以U6为内参。circ_0072083上游引物5’-AAC CAC CAC AGA TTC ACT AT-3’,下游引物5’-AAC CAC CAC AGA TTC ACT AT-3’;GAPDH上游引物5’-ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA CGT AC-3’,下游引物5’-CAC CTT CTA CAA TGA GCT GCG TGT G-3’;miR-142-3p上游引物5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG-3’,下游引物5’-CGA CGT GTA GTG TTT CCT A-3’;U6上游引物’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’,下游引物5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。

1.4 细胞的培养与分组 LoVo细胞接种于RPMI-1640培养基(补充1%青霉素链霉素、10%胎牛血清),置于37℃,含5% CO2的培养箱中孵育。细胞达80%汇合时1∶3的比例传代。取2×104个对数期LoVo细胞接种于24孔板,在细胞50%汇合时,用Lipofectamine 2000试剂进行细胞转染。根据转染寡核苷酸序列不同LoVo细胞共分为si-circ_0072083组、si-NC组、miR-142-3p mimic组、miR-NC组、si-circ_0072083+anti-miR-NC组、si-circ_0072083+miR-142-3p Inhibitor组。转染48 h收集细胞,RT-qPCR检测转染效果后进行后续实验。

1.5 CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖 (1)CCK-8实验:各组LoVo细胞以3 000个/孔接种96孔板置于培养箱培养,24 h后更换为含10 μl CCK-8和90 μl培养液,继续孵育2 h,酶标仪测定450 nm处吸光度(A)。增殖抑制率(%)=(1-实验A/对照A)×100%。(2)平板克隆实验:不同组LoVo细胞置于培养箱以200个/孔接种6孔板培养,每3天更换新鲜培养基,细胞培养约14 d至出现可见细胞菌落。弃去培养液,甲醇固定菌落后用结晶紫染色,显微镜下计数>50个细胞的克隆数。

1.6 Transwell法检测细胞迁移和侵袭 用无血清培养液重悬各组LoVo细胞,为检测细胞迁移情况,将200 μl细胞悬液接种未包被基质胶的上腔室;为检测细胞侵袭情况,将200 μl细胞悬液接种预先涂有50 μl基质胶的上腔室。将500 μl含10%胎牛血清培养液加入下腔室作为趋化因子。培养箱孵育24 h,将膜下表面迁移或侵袭的细胞固定,用1%结晶紫染色。在显微镜下随机选择3个视野进行计数取均值表示侵袭或迁移数。

1.7 Western blot检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达 收集各组LoVo细胞并用细胞裂解缓冲液裂解。测定蛋白浓度后,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离30 μg蛋白样品,并湿转至聚偏二氟乙烯膜。用5%脱脂牛奶封闭膜1 h,然后4℃以下抗体中孵育过夜。E-cadherin抗体(1∶5 000稀释)、N-cadherin抗体(1∶2 000稀释)、内参GAPDH抗体(1∶2 000稀释)。二抗(1∶2 500稀释)与膜在室温下孵育2 h。采用增强化学发光系统检测蛋白表达。

1.8 双荧光素酶报告实验 将LoVo细胞接种24孔板,用WT-circ_0072083或MUT-circ_0072083分别和miR-142-3p mimic或miR-NC共转染。孵育48 h后,测定细胞相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 circ_0072083和miR-142-3p在结直肠癌中的表达 结直肠癌组织中circ_0072083表达水平高于癌旁组织,miR-142-3p表达水平低于癌旁组织。结直肠癌组织中circ_0072083和miR-142-3p表达水平呈负相关(r=-0.61)。见表1,图1。

图1 结直肠癌中circ_0072083和miR-142-3p的表达及相关性分析

表1 circ_0072083和miR-142-3p在结直肠癌中的表达

2.2 沉默circ_0072083对LoVo增殖、迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较,si-circ_0072083组LoVo细胞circ_0072083表达水平、克隆数、迁移数、侵袭数、N-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05),miR-142-3p表达水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表2,图2。

表2 沉默circ_0072083对LoVo增殖迁移侵袭的检测

图2 沉默circ_0072083对LoVo中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响

2.3 circ_0072083靶向调控miR-142-3p circular RNA interactome预测到circ_0072083和miR-142-3p存在结合位点。与miR-NC和WT-circ_0072083共转染组比较,miR-142-3p mimic和WT-circ_0072083共转染组LoVo细胞的相对荧光素酶活性显著下降。见图3,表3。

图3 circ_0072083和miR-142-3p的互补序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.4 miR-142-3p对LoVo增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-NC组比较,miR-142-3p mimic组LoVo细胞miR-142-3p表达水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05),细胞克隆数、迁移数、侵袭数、N-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。见图4,表4。

图4 miR-142-3p对LoVo中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响

表4 miR-142-3p对LoVo增殖迁移侵袭的检测

2.5 抑制miR-142-3p对沉默circ_0072083处理的LoVo增殖、迁移、侵袭的影响 与si-circ_0072083+anti-miR-NC组比较,si-circ_0072083+miR-142-3p Inhibitor组LoVo细胞miR-142-3p表达水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),细胞克隆数、迁移数、侵袭数、N-cadherin蛋白水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5,图5。

表5 抑制miR-142-3p对沉默circ_0072083处理的LoVo增殖迁移侵袭的检测

图5 抑制miR-142-3p对沉默circ_0072083处理的LoVo中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响3 讨论

目前已鉴定出大量与CRC相关的circRNA,并确定其在CRC进展和(或)转移中的作用。据报道,circ_001988表达下调与CRC神经周围侵袭和分化密切相关[5]。circLONP2在体外可增强CRC细胞的侵袭性,高表达的circLONP2预示CRC患者总生存率较差[6]。circFNDC3B在CRC组织中表达较低,其上调可抑制CRC的致瘤性、转移性和血管生成特性[7]。以上表明失调的circRNA可能作为CRC的潜在生物标志物,调控circRNA水平可有助于抑制CRC细胞恶性行为。本研究检测到CRC组织中circ_0072083表达增加,提示其表达失调可能参与CRC进展。转染si-circ_0072083可抑制CRC细胞的克隆、侵袭和迁移能力,增加细胞增殖抑制率。上皮间质转化是肿瘤细胞侵袭转移的先决步骤,其在CRC的转移和复发中起关键作用[8]。本研究显示沉默circ_0072083可上调上皮标志分子E-cadherin水平,N-cadherin水平下调,表明沉默circ_0072083可提高抑制EMT阻碍CRC细胞迁移和侵袭。Wang等[9]报道沉默circ_0072083可抑制肾癌细胞的增殖和转移。此外,Ding等[10]证实敲低circ_0072083通过抑制细胞增殖、侵袭和异种移植肿瘤生长以及增加细胞凋亡来降低胶质瘤对替莫唑胺的耐药性。以上研究表明circ_0072083在CRC中具有致癌功能,沉默circ_0072083可有效抑制CRC细胞恶性生物学行为。

circ_0072083通过与不同miRNA分子结合来调控癌症进展。Wei等[11]证实circ_0072083可作为miR-1261的分子海绵促进甲状腺乳头状癌的发生。Zhang等[12]发现circ_0072083通过靶向下调miR-101-3p在非小细胞肺癌中起癌基因作用。CRC患者血清miR-142-3p水平明显低于健康志愿者,低血清miR-142-3p水平与晚期癌症显著相关[13]。miR-142-3p通过靶向丙酮酸激酶M2(PKM2)调控有氧糖酵解进而抑制CRC细胞侵袭和迁移[14]。miR-142-3p还可作为circ_0087862、circPACRGL的靶向miRNA,并介导沉默circ_0087862和circPACRGL对CRC进展的抑制作用[15,16]。此外,多项研究表明miR-142-3p在肺腺癌[17]、乳腺癌[18]、葡萄膜黑色素瘤[19]中均具有抗肿瘤功能。本研究检测到CRC组织中miR-142-3p表达降低,且与circ_0072083水平呈负相关关系。进一步研究发现circ_0072083对miR-142-3p表达还具有靶向负调控作用。过表达miR-142-3p可抑制CRC细胞的克隆、侵袭和迁移能力,增加细胞增殖抑制率,这与沉默circ_0072083在CRC中的抗癌作用一致,这提示miR-142-3p表达上调可能介导沉默circ_0072083的抗CRC作用。为证实上述猜想,本研究将anti-miR-142-3p、si-circ_0072083共转染CRC细胞,检测细胞恶性生物学行为显示,抑制miR-142-3p表达显著减弱沉默circ_0072083对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,进一步证实circ_0072083通过靶向miR-142-3p调控CRC细胞恶性生物学行为。

综上所述,CRC组织中circ_0072083表达上调,miR-142-3p表达下调。沉默circ_0072083通过上调miR-142-3p水平来抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭。因此,靶向抑制circ_0072083/miR-142-3p轴可能是抑制CRC进展的重要策略。