硫酸软骨素应用于骨修复材料中的研究进展

张 茜，王 畅，梁 琛，曲星源，刘 悦，闫宝君，王 雷

组织工程学和生物材料学被认为是发展再生移植修复骨缺损的重要方式。组织工程学意在将生物材料、细胞以及生物活性分子结合起来，恢复或改善受损或病变组织的生物功能[1]。在组织工程学中，为了提高细胞活力、附着、增殖和归巢、成骨分化、血管化、宿主整合和承重[2]，人们研究了大量的支架材料，发现了硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)在骨再生修复中具有潜在的功效。CS是一类硫酸化的阴离子酸性黏多糖，具有多种生物学特性，本文拟就CS的生物学特性、在成骨修复中的作用及在骨组织工程中的应用作一综述。

1 硫酸软骨素的生物学特性

CS由D-葡糖醛酸(glucuronic acid，Glc A)和N-乙酰-D-氨基半乳糖(N-acetyl-D-galactosamine hydrate，Gal NAc)通过β-1，3糖苷键重复连接而成，一般含有50～70个二糖单位[3]，广泛分布于组织细胞外基质和细胞表面，在生物体内多以蛋白多糖的形式存在，是构成动物软骨、腱、气管、喉骨、皮肤等结缔组织的重要组成部分[4]。根据硫酸盐基团在N-乙酸基-D-氨基半乳糖中位置不同， 可分为硫酸软骨素O、A、C、D、E等，即CS-O、CS-A、CS-C、CS-D、CS-E等[5]。除了硫酸盐基团位置的可变性外，不同的硫酸盐基团也具有明显不同的生物活性，例如岩藻糖基硫酸软骨素的硫酸化岩藻糖残基有抗炎、刺激造血等多种活性[6]。CS具有重要的生物学特性，研究表明，CS具有促进软骨再生、抗炎[7]、抗氧化[8]等功效。CS发挥作用主要依靠两种方式：一是自身带电荷的离子基团与其他物质发生作用；二是调节信号通路中的生物分子进而引发机体反应。

1.1 电荷相互作用

由于CS是一类硫酸化的阴离子酸性黏多糖，带负电荷的它具有吸引离子的潜力，其磺酸基和羧酸盐基可与带正电荷的基团，如钙离子，通过离子键发生强烈反应，形成共价键，从而能够在矿化中心分离钙离子，并控制骨组织钙化时的晶体生长[9]。此外，研究表明，CS还可通过离子相互作用与蛋白质共价结合，例如与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的各种生长因子和成分结合，而其中一些蛋白质可能具有致敏和(或)不耐受能力，能够引发机体免疫反应，并赋予CS抗氧化特性，减少骨破坏、软骨细胞死亡和基质成分的分解[10-12]。

1.2 调节信号分子

研究发现，CS可以作为可溶性配体的共同受体，参与Wnt信号通路(Wnts)，与成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和其他细胞因子相互作用，调节细胞形态发生，参与成骨[5，13]。Korotkyi等[14]将CS应用于骨关节炎(osteoarthritis，OA)，发现CS抑制软骨细胞和滑膜细胞中核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)亚基1的激活和核转位。 NF-κB是一种关键的调节因子，调控许多参与组织炎症和细胞募集的病理生理学的基因表达[15]。由此推断，CS可调节炎症通路，降低炎症因子水平，减少软骨细胞损伤，从而调节软骨下骨的改建。

2 硫酸软骨素的促进成骨修复作用

骨的生成是一系列复杂的生物化学发展过程，可分为骨细胞的增殖、细胞外基质的聚集和骨组织的矿化三个时期[16]。在此过程中，ECM分子在组织生长和细胞分化过程中起着关键作用， 而CS是ECM分子的重要组成部分。研究发现，CS可以通过包括调节成骨分化、免疫调节、促进细胞增殖和生物矿化在内的多种途径促进骨的修复和新骨形成[17-18]。

2.1 调节成骨分化

在成骨分化过程中，细胞因子的表达起关键作用。研究发现，CS与BMP-2协同促进干细胞成骨分化，促进碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ，COLⅠ)的表达[17]。ALP是成骨细胞基质成熟的生物标志物，OCN是一类维生素K依赖的钙结合蛋白，这两者是参与成骨分化和ECM矿化过程的重要成分[19]。此外，CS还可以通过Smad1-Smad5-Smad8途径发出信号，以增加与Runt相关的转录因子2(runt-related transcription factors 2，Runx2)的表达[20]。Runx2是成骨细胞分化过程中的重要转录因子，在间充质和其他干细胞成骨分化开始时具有重要意义，它作用于下游信号，促进重要成骨细胞蛋白的表达[21]。此外，Elango等[22]基于成骨细胞对破骨发生的旁分泌研究发现，CS可下调破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand， RANKL)的表达，减少破骨的发生，促进新骨生成。由上可知，CS通过促进成骨标志物和/或降低破骨因子的表达来调节成骨。

2.2 免疫调节

免疫调节在成骨过程中发挥重要作用，研究证实CS具有显著的免疫调节功能，可以通过重塑局部免疫微环境、抑制纤维增生调节干细胞向成骨分化，上调成骨标志物表达，促进骨再生[17]。局部免疫微环境的改变离不开免疫细胞和调节因子的作用，而不同的淋巴细胞亚群及相关细胞因子在成骨过程中发挥了特定的作用。免疫细胞在骨损伤后立即进入骨破坏部位，并通过向损伤部位招募辅助细胞来促进愈合的初始阶段。有证据表明，活化的T淋巴细胞可以通过可溶性因子(如RANKL)的产生促进成骨细胞的成熟，有利于骨的修复[23]。事实上，在骨损伤后，炎症反应随即发生。研究发现，炎症细胞因子的积累可介导氧化应激损伤，促进破骨细胞增殖，增加骨吸收，从而导致骨质疏松症[24]。 由此可见，如果可以减轻炎症的发生发展，就可以减少骨组织的破坏，进而促进骨再生。Li等[2]发现，CS能调节巨噬细胞从M1向M2的表型转换，促进白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10和TGF-β等修复细胞因子的表达，将局部免疫微环境状态从致炎转变为抗炎，促进干细胞募集、黏附和增殖，上调成骨标志物的表达，实现骨修复。此外，CS有效减少金属蛋白酶-9 (metalloproteinase-9，MMP-9)、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)等致炎因子水平的增加，减少炎症的积累，为骨稳态的平衡提供了帮助[25]。显然，这些炎症分子的表达和(或)活性的降低可能解释了CS发挥其免疫调节作用的机制。然而，免疫调节成骨是一个非常复杂的过程，需要局部免疫反应激活细胞成骨标志物表达，在信号的刺激下新骨形成[26]，而CS在此过程中的具体作用仍需进一步研究。

2.3 调节生物矿化

在骨再生过程中，生物矿化是硬化组织的一个重要过程。最常见的生物矿化物是钙和磷酸盐，它们与有机聚合物结合形成磷灰石晶体，为骨骼提供结构支持。CS作为非胶原蛋白聚糖之一，在调节软骨和骨组织的生物矿化中起着至关重要的作用。Kim等[18]在研究中发现，利用CS作为成核位点，初始时可以有效吸收钙离子，并吸引一些负离子，如磷酸盐，进行钙磷沉积，加速生物矿化过程。可见，CS具有积聚离子的潜力，可诱导细胞的生物矿化促进成骨。

2.4 促进细胞增殖

骨修复离不开骨细胞增殖。有学者发现，CS通过激活TGF-β/Smads通路，诱导细胞内钙离子水平升高，影响细胞周期，对软骨细胞产生增殖作用[27]；CS可影响生长因子和其他细胞因子的固定，并通过整合素或其他特定受体与骨细胞(如成骨细胞和破骨细胞)相互作用，直接或间接影响这些细胞的黏附、迁移、生长、增殖和分化[28]。

2.5 其他

除了上述作用，CS还具有选择性蛋白结合抗性，可以降低血小板黏附，促进内皮细胞和间充质细胞的黏附[12]，进而促进细胞的分化，有利于骨的改建。

3 硫酸软骨素在骨组织工程中的应用

CS作为一种资源丰富性能优异的生物分子， 因其显著的骨修复作用而被广泛用于骨组织工程医学领域，尤其是在颅面和口腔医学。骨组织工程是利用支架材料诱导周围组织成骨， 或将支架材料作为植入骨细胞或其他药物的载体或模板[29]。研究表明，CS被广泛应用于细胞支架、表面涂层、生物黏合剂及药物递送系统等，形式多种多样。Singh等[9]制备了CS与壳聚糖、纳米生物玻璃结合的复合支架，发现CS促进COLⅠ的表达和生物矿化，增强ALP活性，证实了该复合支架促组织再生的潜力。Andrews等[13]制备了CS糖胺聚糖支架水凝胶，并研究其对重组人骨形态发生蛋白传递的适用性，证实了它可调节骨TGF-β1和BMPs信号，并介导临界大小的骨缺损的再生，增强成骨细胞矿化。Ye等[19]制备神经生长因子——硫酸软骨素/羟基磷灰石(neurogrowth factor-chondroitin sulfate/hydroxyapatite，NGF-CS/HA)复合钛涂层，证明此涂层能够显著提高ALP活性，上调OCN和Runx2，对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞的分化有显著的促进作用。Kong等[21]将CS和COLⅠ组装到聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的仿生涂层，结果显示其也能够支持BMSCs的附着、增殖和成骨分化。除此而外，有学者将CS引入磷酸钙水泥(calcium phosphate cement，CPC)中，发现CS-CPCs加速了纤维连接蛋白的优先吸附，上调了BMSCs中骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和ALP的表达，改善了BMSCs的黏附、增殖和成骨分化[28]。还有学者将硫酸软骨素用于软骨再生的ECM生物墨水，为BMSCs的软骨分化提供了理想的化学和机械微环境[30]。越来越多的研究表明，CS可与高分子化合物和生物活性分子物质用于仿生材料复合物制备，证实CS在成骨修复中的作用。

4 展 望

在组织工程医学中，CS仿生材料引起显著的关注，其与基因治疗相结合成为研究热点。然而，由于CS种类繁多，应用形式多样，材料各组分比例也会影响成效，CS促进成骨的具体机制仍需进一步研究。此外有学者发现，天然CS具有复杂的结构和不均匀的组成，导致其生理功能和应用受到明显的限制[31]。近年来，天然CS在分子水平上已经为调控细胞行为提供了一种有效的策略，但如何合理设计和合成具有特殊成分和结构的CS仿生材料协同调控细胞成骨和成软骨分化仍然是一个巨大的挑战。因此，在未来的研究中，希望不仅关注CS仿生应用，还有CS在骨修复中的调控机制。同样要指出的是，高性能CS的质量是制剂安全和有效的先决条件[32]。总之，已有研究证明了CS在骨再生修复方面的潜力和在组织工程学中广阔应用的前景，在未来的应用中，CS应该是一种值得青睐的选择。