三维打印血管的研究进展

陈艺菲，张辰玥，张璟岚，张滨婧，戎 鑫，胡芝爱

人造器官和组织可用于药物评价、器官移植等多个方面，具有非常诱人的应用前景。人造组织的技术在再生修复牙髓坏死、颌面创伤、颌面肿瘤切除等导致的口腔颌面部组织缺损方面具有重要意义[1-2]。但目前人造器官和组织的研发还面临诸多瓶颈，其中一项是欠缺有效的血管化。在缺乏充足血管网络的情况下，组织深部氧气和营养物质的供应受限、代谢产物不能及时排出，可能导致器官及组织中心部位细胞的坏死[3-4]。

促血管再生的方法包括细胞共培养、生长因子诱导、脱细胞血管支架、细胞膜片、三维(three-dimensional， 3D)打印等。向组织工程结构中添加生长因子能够诱导血管新生[5]，但生长因子的半衰期较短且价格昂贵，并且其特异性也缺乏具体的研究[6]。脱细胞血管支架虽能在促血管化的同时避免宿主免疫排斥反应，但脱细胞技术仍有许多问题亟待解决，例如：残留的洗涤剂和酶引起的不良反应，细胞去除不彻底，破坏细胞外基质的结构和机械完整性，脱细胞支架的灭菌及体外保存技术等[7]。细胞膜片技术虽能提高细胞生存率，但由于细胞膜片叠加层数有限，以其构建功能化血管的方法较为复杂[8]。

近年来，3D打印技术飞速发展，并被应用于多个领域。3D打印技术指在个性化数字设计的基础上，通过分层沉积材料的方式构建物理对象的过程。3D生物打印(bioprinting)技术指活细胞与生物材料的共同打印，以个性化数字设计为蓝本逐层打印，以制造最大限度模仿自然组织特征的活体结构[9]。3D生物打印提供了一种具有高度可控性、可复制、可扩展的组织重建方法，可应用于诸多领域，包括再生医学、体外疾病建模等[10]。

传统的挤出式生物打印技术适用于机械性能强的高黏度生物墨水，而构建血管的生物材料具有质地柔软、黏度较低、较难成形的特点[11]，为克服生物材料成形性能的限制，打印高精度且具有生物功能的血管结构，同时促进血管再生及组织修复，三维打印使用的材料与方法得到了改良。现就三维打印血管的研究进展作一综述，简述几种可构建血管结构的改良3D打印技术，并分析其优缺点及发展前景。

1 3D打印血管的前沿技术

1.1 悬浮打印

挤出式生物打印是应用最广泛的打印方法，适用于多种生物材料的打印，但在构建高精度组织时仍需改进。悬浮打印在挤出打印的基础上引入了悬浮介质，将打印喷头直接置于悬浮介质中进行打印。如图1所示，悬浮介质应具有剪切变稀特性，即在低剪应力下表现为刚性固态，而当打印喷嘴运动产生的剪应力增加至高于屈服应力时则表现为流动性良好的黏性流体。故喷嘴移动后随着剪应力逐渐减小消失，原位置周围的支持浴又重新变为固态。该特性保证了打印结构能够实现自支撑，即使是在打印低黏度生物材料时也能保证打印结构不易坍塌变形[12]。明胶、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)， Pluronic F-127)、锂藻土(laponite)等生物材料因具有这一特性，具备成为悬浮介质的潜力[13]。同时由于喷嘴可以在悬浮介质中自由移动，悬浮打印还能实现全方向打印而不仅局限于自上而下的逐层沉积。这些优点使悬浮打印适用于高效构建血管网络等高精度结构[14]。

根据悬浮介质的用途，悬浮打印血管网大致可以分为两类[14-15]。一类(图1a)是将悬浮介质作为成形材料，去除打印的材料，形成包含血管网络的中空血管化结构；另一类(图1b)是将悬浮介质作为牺牲材料，成形后保留打印的血管化结构[16]。

悬浮打印通过打印针头移动时产生的剪切力变化改变悬浮介质流变性。a：保留悬浮介质，将打印墨水作为牺牲材料在打印结束后去除，得到预留血管形态的中空结构；b:去除悬浮介质，将悬浮介质作为牺牲材料在打印结束后去除，得到高精度血管结构

1.1.1 保留悬浮介质

通过保留悬浮介质，可构建含有可灌注血管结构空腔的组织结构。该方法既能打印内部结构又能构建外部轮廓，在根据特定组织缺损的医学成像定制植入式血管化人工组织方面具有较高的利用价值。

Wu等[16]利用Pluronic F-127作为牺牲生物墨水在屈服应力流体丙烯酰基Pluronic F-127(Pluronic F127 diacrylate， PF127-DA)中打印微血管，光固化悬浮介质后在4 ℃下去除液态的牺牲材料，最终全向打印出了3D仿生微血管网络结构，但由于PF127-DA的自愈能力较差，打印的分辨率还需提高。除了Pluronic F-127，明胶也可以作为牺牲材料。Fitzsimmons等[17]比较了Pluronic F-127和明胶作为牺牲材料悬浮打印血管时的性能，发现Pluronic F-127因具有更大的压缩模量及更好的可打印性，在打印精度上略高于明胶，但加入透明质酸的明胶因为黏度增加则比Pluronic F-127更能抵抗塑性变形，因此在作为固态牺牲材料提供结构支撑的情况下更有利于保持血管化结构的稳定性。

1.1.2 去除悬浮介质

以牺牲悬浮介质的方法打印血管时，在去除悬浮介质时尽可能降低对打印结构完整性和细胞活性的影响是成功打印的关键，这与悬浮介质的选择密不可分。明胶、Pluronic F-127等温度响应材料能在不损伤细胞活性的温度范围内实现固、液态转变从而便于去除，常用作牺牲悬浮介质[18]。

明胶因具有良好的生物相容性及优秀的成形性，是作为悬浮介质的重要材料之一，其在室温下为固态，在37 ℃则熔化为液态。利用明胶的热可逆性，Hinton等[11]以4.5%(质量浓度)明胶和CaCl2溶液混合用作悬浮介质支持浴，在其中嵌入打印海藻酸钠形成血管树结构，最后加热至37 ℃熔化并去除明胶浆，得到了高保真且可灌注的血管树结构。Kreimendahl等[19]在此基础上将打印墨水替换为混合人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVECs)的纤维蛋白(Fibrin， FIB， 10 mg/mL)-透明质酸(hyaluronan， HA， 5 mg/mL)溶液，这种低黏性的纤维蛋白生物墨水能更好地模拟细胞生长的环境从而促进血管形成。

为了进一步增加悬浮介质对剪应力的敏感性，Afghah等[20]将触变性较好的锂藻土与Pluronic F-127结合，得到了自愈能力更好的剪切变稀复合材料支撑浴，该体系可高保真地连续印刷复杂大型的结构，同时保证较好的生物相容性，可用于复杂血管网的生物打印。

1.2 同轴打印

同轴生物打印是一种可以直接打印负载细胞的血管结构的方法。如图2所示，在同轴生物打印血管中，具有所需组织细胞和内皮细胞(endothelial cells， ECs)的生物墨水分别从同轴喷嘴的外部和内部同时打印，因此，打印所得的组织大多由鞘-芯纤维组成，当纤维中的芯结构溶解形成通道时，其中的ECs会自动沉积并黏附于通道“鞘”的内壁上[21]。现将同轴打印血管常用的“鞘”“芯”材料总结于表1。同轴生物打印在血管化组织的制造方面具有诸多优势，包括：精确控制鞘-芯部位材料的同时沉积，打印材料选择广泛，打印过程一步到位，可调节的释放曲线以及通过内部交联提高分辨率等优点。重要的是，同轴生物打印的组织结构已被证实可以具备良好的生物学性能，打印的血管化结构易与宿主整合[22]。同轴生物打印可以实现多级血管的打印，可打印的血管结构包括10～300 mm的动脉和静脉、直径为0.02～0.08 mm的小动脉和小静脉以及直径通常为0.005～0.01 mm的毛细血管[23]。

图2 直接同轴生物打印

表1 同轴打印常用的“鞘”“芯”材料

显而易见的是，在同轴生物打印中，用于外部封装细胞的生物墨水和牺牲墨水的特性，是决定其能否直接打印血管通道的重要因素。首先，两者都需要具有优越的生物相容性。除了常见的牺牲材料明胶，甲基丙烯酰明胶(gelatin methacryloyl， GelMA)作为一种光固化明胶的衍生物，因其具有可控的理化性质及良好的生物相容性，可作为外部封装细胞的生物墨水[28]。利用明胶及GelMA进行同轴打印的步骤如图2所示，首先将GelMA及明胶分别与组织细胞和内皮细胞混合，前者作为“鞘”，后者作为“芯”进行同轴打印，直接构建具有血管通道的生物组织结构[21]。通过该种方式可以用于具有血管通道的大规模复杂组织或器官，并且省去后续的细胞播种以提高制造效率。

除了负载细胞，同轴打印还可以通过负载药物、生长因子，促进血管形成[29-30]。这证明了同轴生物打印是构建可灌注血管并同时运输细胞及药物的有效方法，以该方法制造的具有可灌注血管结构的组织，在组织修复和再生领域都展现出较高的应用价值。

1.3 4D生物打印

3D生物打印技术通过模仿及复制体内细胞与细胞外基质的三维结构，促进组织及器官的再生，但无法非干预、动态地构建三维结构。为使生物打印结构的几何形状能针对外部刺激进行改变，引入时间概念的4D生物打印技术逐渐兴起，“智能”可变材料也随之出现[31]。变形效应(shape-morphing effect，SME)是“智能”材料的固有属性，即材料在外界刺激下形状变化或恢复的能力[32]。变形效应可以由温度、湿度、光照等多方面的刺激产生，从而使打印结构的形状随时间改变，从而成功引入第四维度——时间，同时并不会损伤细胞或组织结构[31]。

具有变形效应的刺激响应材料是4D生物打印的关键。根据刺激响应的种类，其可被分为物理刺激响应材料、化学刺激响应材料、生物刺激响应材料和组合刺激响应材料[33]。物理刺激包括温度、水分含量、光照、磁场、电刺激等，通过改变物体内部的原子排列结构而使其发生形状变形；化学刺激是通过pH值或离子浓度的改变刺激4D打印产物发生形状变化；生物刺激依赖于参与人体生物信号反馈通路的小分子或大分子物质进行[34-35]。随着生物组织工程学的进步，刺激响应材料也被发现可用于血管结构的4D打印。

Arakawa等[36]利用光照降解光敏材料实现了精细内皮化血管及载细胞的复杂多层血管结构的4D制造；Lai等[37]利用一种温度响应水凝胶聚合物在人体温度下实现了立体血管状结构的自折叠组装，较完整地保存了细胞活性；Song等[38]开发了一种在生物刺激响应水凝胶内打印复杂微通道的技术。首先，内皮细胞附着于3D打印的复杂微通道上，相融合形成单层血管壁，当内皮细胞暴露于血管生长因子时，产生蛋白酶降解水凝胶并在水凝胶中出芽形成血管分叉及新的血管通路。

4D生物打印技术既可以帮助复杂精细血管系统的体内外建造，并且能控制打印结构中药物及生长因子的释放，促进血管化结构的生长[37，39-40]。但是部分刺激信号会对细胞产生负面影响[40-41]，在现有研究中，仅证实了温度(4～40 ℃)[41]和钙离子浓度[42]改变既可以引起形状变换又不对细胞产生负面影响。

1.4 其他

除了上述的打印方法，还有一些方法也具有构建高仿真的血管结构潜力，但在实际应用方面具有较大局限。

在传统3D打印方法的基础上，Yang等[43]将挤出技术和喷墨技术相结合，双喷嘴打印可灌注血管通道。这种方法首先利用气动挤出喷嘴逐层打印光固化水凝胶以构建具有内部通道凹槽的自支撑结构，再利用压电式喷嘴在内部通道凹槽中喷射式打印牺牲水凝胶以填满、支撑内部通道。在内部结构打印完成后，继续挤出光固化水凝胶以覆盖内部牺牲材料达到预设的厚度。在打印及光固化完成后，填充内部通道的牺牲材料被去除，留下具有可灌注血管通道的水凝胶块。这一方法在厚组织再生中具有一定的应用价值，但是在打印分辨率和结构保真度上仍存在提升空间。

除了利用化学材料作为血管结构的支撑，一些物理场如磁场、声场也能实现悬浮打印的效果。这种方法首先将细胞制备成组织球体，再在物理场中实现组织球体的悬浮组装，在确保生物安全性的同时具有构建高精度复杂结构如血管网结构的潜力[44]。Parfenov等[45]结合磁、声场构建的空心管状结构具有良好的生物活性。这种方式省略了去除临时化学支撑物的步骤，但是装配组织球体的过程较复杂，且成本较高。

2 3D打印血管在口腔颌面的应用前景

口腔颌面部的软硬组织重建离不开血管化，血管化游离组织瓣广泛应用于口腔颌面部大面积组织缺损的修复。3D打印血管的技术同样可以用于口腔颌面部软硬组织血管化工程[46]。

悬浮打印方法可以通过设计悬浮介质支持浴及生物墨水的组合同时构建心脏、骨组织等结构及内部为血管生长预留的通道[47-48]，这提示悬浮打印具有体外构建预血管化软硬组织植入物的潜能，在颌面部软硬组织重建中具有研究价值。

同轴打印同样能参与预血管化组织植入物的构建。Twohig等[49]通过在生物陶瓷骨支架中同轴打印负载人体间充质干细胞(human mesenchymal stem cells， hMSCs)和ECs的GelMA微通道，在体外培养三天内骨支架内部形成了丰富且稳定的内皮化通道；Li等[50]将HUVECs负载在同轴打印定制的微血管结构内部，再通过注射方式均匀分散到负载间充质干细胞的软硬组织模型中。结果显示引入微血管结构的软组织植入物内部表现出血管生成行为并出现血管网络；在骨组织模型中，微血管结构的植入能显著促进成骨分化。体内实验结果表明，含有微血管结构的水凝胶能迅速与宿主血管吻合形成新的供血通道。体内外实验证明了通过3D打印制造的可注射微血管结构为预血管化植入物的制造提供了一种灵活而便捷的方法，微血管结构的引入在颌面皮肤、口腔黏膜、肌肉等软组织及颌骨、牙槽骨等硬组织的修复重建中具有潜在的临床应用前景 。

除此之外，4D打印的概念也逐渐被引入血管化组织制造中。Benmeridja等[51]通过打印封装脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ASC)与HUVECs (ASC/HUVECs) 共培养球体的GelMA构建了自组装的血管化脂肪组织，其中ASC能够在成脂分化的同时引导血管网络的形成，推进了血管化脂肪组织再生的研究，有潜力应用于颌面部凹陷性软组织缺损的体内修复中。

3D打印的血管化组织植入物能通过与邻近的宿主血管融合而在早期为移植部位建立血供，提高植入物的存活率，是再生医学及组织工程学修复的发展方向，3D打印血管化植入物有望成为修复口腔颌面部骨、皮肤、肌肉等软硬组织的新选择。

3 小结与展望

综上所述，3D生物打印血管的技术日益精进，在传统方式上改良的打印技术更好地模拟了血管的形态与功能，有潜力用于制造血管结构。组织工程的血管再生研究在骨、牙髓、皮肤、黏膜等组织再生方面具有决定性作用[52-53]，3D打印血管技术的研究进展推动了预血管化组织植入物的制造，在口腔颌面部组织再生修复领域具有广阔的研究前景及潜在的应用价值。但一些方法尚未投入临床试验，且存在制造成本较高、打印步骤较复杂等缺点，仍需要不断创新和进步。