壳聚糖基微球在口腔组织病损治疗中的研究进展

周华俊，丁榆德，杨 帆

壳聚糖是由自然界储量丰富的几丁质经酶处理或化学处理的方法，脱去部分乙酰基后得到的一种有机高分子材料。它具有生物相容性良好、抗菌等特性[1]。药剂学上的微球(图1)通常是指药物溶解或分散在纳米和微米尺度的球形或类球形物体。微球需使用微球加工技术制备而成，有更大的比表面积，利于细胞黏附和增殖，提高药物的传送能力，在药物载体、组织工程学支架等应用方面具有一定优势[2]。而壳聚糖的可塑性强，是目前制备微球的主要材料之一，可通过乳化交联法、离子凝胶法、喷雾干燥法、凝聚沉淀法加工成壳聚糖基微球(chitosan-based microspheres，CBM)[3-6]。口腔作为一个特殊的“外环境”，局部用药容易受进食以及唾液的影响，维持药物足够的缓释时间往往是治疗的难点。口腔组织缺损修复是一个周期性的过程，持续的药物释放对于组织反应的诱导作用更具有长效性。这就十分考验口腔用药载体的性能。CBM是一种易于加工，且具备良好载药性能的药物载体，同时，在口腔组织再生领域中还能起到支架的作用。目前，CBM在口腔临床中的应用仍处于基础研究阶段，尚未真正应用于临床。本文就目前国内外对于CBM在口腔颌骨组织缺损、牙周病损、牙体牙髓病变及神经组织损伤治疗方面的研究进展作一综述，为后续研究及最终实现临床应用提供参考。

图1 沉淀法制备的壳聚糖微球电镜观察

1 CBM在颌骨缺损修复中的作用研究

1.1 CBM搭载生长因子

用有机高分子材料作为骨再生支架，一直是颌骨缺损修复的研究热点。壳聚糖良好的生物相容性、可降解性、无毒性及抗菌活性使其受到众多学者关注和研究[7-9]。另外，微球可以负载蛋白类生长因子，并起到保护和缓控释生长因子的作用[10]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是成骨生长因子之一，其骨诱导能力得到了动物学以及人类临床研究的证实[11-12]。为了延长BMP-2的释放时间，Xia等[13]采用离子凝胶法制备硫酸葡聚糖壳聚糖微球的载药系统，相对于单纯壳聚糖微球，阴离子硫酸葡聚糖先与BMP-2结合，再与阳离子壳聚糖搅拌成球，实现了更高的蛋白质包封率和加载比。同时，使得保持活性的BMP-2从该微球中持续释放超过20 d。另一项动物实验进一步研究了载BMP-2的CBM在雄性大鼠体内的异位成骨能力，证实壳聚糖/BMP-2微球系统显著增强了BMP-2对异位成骨的诱导和促进作用[14]。这些研究结果均提示利用CBM搭载BMP-2在临床修复骨缺损方面具有巨大的潜力。

但是，单纯壳聚糖微球本身机械强度不足，单独载药使用时，无法有效维持骨增量空间。于是，学者们尝试将壳聚糖复合其他材料，来提高骨增量过程中材料的机械性能，在调控载药微球缓释效率的同时，保证成骨过程的空间[15-16]。例如，Thangavelu等[15]通过离子交联微球技术对现有植骨材料的再加工，混合双相磷酸钙，来提高CBM的力学性能，并证明其相较单纯CBM具备更佳的骨传导性能。Sobhani等[16]制备了一种新型磷酸钙/聚磷腈多孔支架，与采用乳液离子法制备且载有BMP-2的CBM结合，研究其在骨缺损修复中的效果。研究发现，与单独支架相比，载有BMP-2的支架既增加了细胞的成骨分化潜能，又克服了单纯壳聚糖微球作为成骨材料强度不足的缺点，还改善了微球搭载BMP-2突释的问题，为最终实现CBM搭载生长因子的临床应用提供了新方式。

1.2 CBM增强屏障膜强度

在骨缺损修复中，屏障膜也是必不可少的材料之一。在骨缺损区填充骨材料后，表面覆盖的屏障膜起到阻止成纤维细胞长入的作用，使得成骨细胞有充足的时间长入成骨材料之间进行骨组织重建。但是，现在使用的胶原屏障膜经常存在强度不足的问题，在骨引导再生(bone guided regeneration，GBR)过程中无法维持良好的成骨空间。而CBM在复合加入屏障膜的结构中后，不仅可以作为屏障膜中的药物载体，同时也大大提升了膜的强度。有学者将纳米羟基磷灰石/CBM加入壳聚糖膜中，发现它的抗断裂强度是单纯壳聚糖膜的3倍[17]。可见这种屏障膜在引导骨再生的应用中具有一定的前景。可以推测，CBM的添加，使得屏障膜的强度得到提升，可减少临床技术敏感性，使骨增量的疗效更具可预期性。

1.3 改性CBM双相载药功能

壳聚糖还可通过接枝羧基改性，经氯乙酸醚化后，得到水溶性的壳聚糖衍生物，提高成球后的降解速率。微球在控释药物的方面具有可注射性、低毒、高效等优点，实验发现在小鼠骨愈合过程中，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达在早期达到峰值，而BMP-2表达在后期达到峰值[18-19]。Dou等[20]采用乳液法并用香草醛交联制备羧甲基壳聚糖微球，以微球和胶原分别载药，构建了具有BMP-2和VEGF双因子复合的二级结构缓释系统，支架实现了双因子的顺序释放，VEGF和BMP-2双因子的支架比仅有BMP-2的支架组有更多的胶原蛋白组织和新血管形成，最终促进成骨作用。多因子的协同作用可以降低药物使用剂量，增强疗效。利用CBM载药功能可达到多因子协同作用，为实现高效的骨再生提供了新方法。

2 CBM在牙周病损中的修复中的作用研究

2.1 CBM搭载抗菌药物

牙周疾病中，牙周或种植体周的炎症反应伴随始终，疾病末期还会出现骨丧失的现象。临床中的非手术治疗手段包括牙周基础治疗和药物治疗，而针对牙周袋这种局部的感染，局部用药往往能避免全身用药并发症，并获得一定的疗效[21-22]。但是，牙周袋内的局部用药会受到口腔环境的影响，唾液的冲刷、稀释作用都会导致药效维持时间过短，无法获得满意的疗效。而CBM所具有的载药性能、黏膜黏附性能，正是牙周局部用药所需要的特性[23]。Yadav等[23-24]先采用离子凝胶法载抗菌药的CBM，后又改良加入海藻酸钠，控制了微球突释，延长了药物释放时间，都验证了两种微球在黏膜的黏附和释药作用，且拥有抗菌活性，为牙周今后的局部用药研究提供了新的思路。

随着种植体的广泛使用，种植体周围炎的发病率逐年增高。种植体周围炎的抗菌治疗与牙周炎的治疗方式相似，但因为种植体特殊的纳米表面特征，种植体周机械清创的效果比牙周差，更需要抗菌药物的协同作用。Yoon等[25-26]进行了载米诺环素的壳聚糖-海藻酸钠微球(chitosan-alginate，CA)用于比格犬种植体周围炎和种植体黏膜炎的动物学实验，发现该微球表现出了长而持久的抑菌效果。对于动物种植体周的炎症治疗，聚丙烯酸酯甘油微球(polyacrylate-glycerin，PG)组在第14天已无药物残留，CA组可以检测到药物。体外抗菌实验中，CA组的抗菌时间为(7.0±5.7)d，而PG组为(1.2±2.6)d。说明CA在药物缓释时间和抗菌能力上更具优势。该载药系统在未来临床上有希望成为重要的辅助治疗手段。

2.2 CBM的支架作用

牙周炎发生后导致的牙槽骨吸收是临床中最常见的并发症。因此，牙周炎的治疗不仅要对牙周的感染进行控制，临床工作者更希望控制感染的同时，能对丧失的牙槽骨进行牙周组织的引导再生。关于牙周组织再生的文献主要围绕干细胞与其他支架展开相关研究，但CBM与牙周组织再生相关的研究报道较少。目前牙周再生目标是引导具有再生能力的细胞重新修复缺损区并建立新的牙周附着[27]。Inanç等[28]将人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)加载到壳聚糖-羟基磷灰石微球上后，发现其表现出一定的成骨分化潜能，并观察到hPDLFs在体外诱导后能够在二维和三维培养条件下进行成骨分化，因此认为在微重力生物反应器中的壳聚糖-羟基磷灰石微球可作为合适的三维环境来支持体外hPDLFs的成骨分化，该实验验证了CBM能够作为支架，具有引导牙周组织再生的潜能。但目前的研究仍处于基础阶段，要实现牙周膜成纤维细胞的组织再生或建立牙周重新附着的目标还有很长的路要走。

3 CBM在牙体牙髓病损的治疗中的作用研究

3.1 CBM搭载氟轻松和生长因子

牙齿发育有不同的阶段，年轻恒牙期的牙根还未发育完全，但可能会因为外伤、龋病等原因，导致牙髓炎症，甚至是根尖周炎。为了促使根尖继续发育，解决牙根抗力差的问题，以氢氧化钙为基础的根尖诱导成形术是目前临床广泛使用的治疗方法之一。但其治疗周期长，需要多次换药，从而有增加感染的风险[29]。研究已证明BMP-2能够诱导牙乳头细胞向成牙本质细胞分化，形成牙本质[30]。现有学者将CBM作为生长因子载体应用于牙本质诱导的研究。持续炎症存在会影响骨形成，Niu等[31]基于此开发了一种共聚乳酸-CBM，它是由共聚乳酸-壳聚糖的纳米球先包裹疏水性药物氟轻松，再混合亲水性生物分子BMP-2，由三聚磷酸盐交联成微球，并可同时抑制炎症和促进牙体组织矿化相关因子的表达。该微球载药平台有望能控制年轻恒牙的感染和促进组织发育，为根尖发育不足的诱导治疗提供了新思路，也是一种同时搭载疏水药物与亲水药物的优良载体。

3.2 CBM搭载转化生长因子

牙体组织缺损是临床常见的疾病之一，医生常使用的是氢氧化钙和生物陶瓷作为盖髓材料，保留牙髓组织，促进修复性牙本质形成。已有研究证明转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以作为盖髓剂诱导修复性牙本质形成[32]。Li等[33]采用乳液交联法制备含TGF-β1的CBM，且微球被双层壳聚糖膜所包被，它由一侧的致密膜和另一侧的大孔海绵组成。其原理是使用致密的薄膜来阻止细菌入侵穿孔的牙髓，并使用含有TGF-β1的微球加载到多孔海绵进行缓释。该动物实验中观察到含有TGF-β1的微球产生的修复牙本质厚度比不含TGF的商用Dycal或壳聚糖双层膜厚3～6倍，具有更显著的修复牙本质疗效。因此，利用CBM包含TGF-β1的新型牙科材料有可能是实现牙髓组织再生的新选择。

4 CBM在神经组织损伤修复中的作用研究

4.1 CBM搭载神经生长因子(nerve growth factor，NGF)

腮腺与面神经的解剖位置关系紧密，口腔颌面外科手术中，常因腮腺肿瘤的切除造成面神经功能障碍进而影响生活质量。目前，自体神经移植是治疗周围神经损伤的金标准，但仍有很多的局限性。所以人工神经移植物仍在研究中，而壳聚糖是人工移植物材料之一[34]。人工神经移植物也需要生长因子的帮助。NGF具有促进周围神经修复、保护神经元、促进神经再生、引导轴突生长和营养作用[35]。Zeng等[36-37]采用乳液离子交联法制备了载NGF的CBM，发现其具有7 d持续释放NGF的能力。然后，将该CS微球加入具有纵向微通道的胶原-壳聚糖支架，其持续释放生物活性NGF的时间提升至28 d。Zeng等[38]又进一步改良，制备了负载NGF的壳聚糖/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)复合微球，再一次延长缓释时间，并在动物实验中证实了壳聚糖/PLGA-NGF微球能促进大鼠坐骨神经再生并阻止了腓肠肌萎缩。在神经修复再生的研究领域中，CBM在控释生长因子方面有一定的优势，利用壳聚糖的载体作用，有可能推动该研究领域的进一步发展。生物3D打印机可以模拟人体组织微观结构，通过3D打印技术制作的多孔纤维结构较传统胶原类材料更利于细胞生长爬行，利于软组织修复[39]。结合3D打印技术，载药CBM结合生物支架将可能在神经修复再生领域有更优异的表现。

4.2 CBM负载促神经修复作用的中药提取成分

口腔诊疗过程中，周围神经的损伤发生率较高。神经损伤后的治疗以营养神经和促进神经修复的全身药物为主，但临床疗效不佳。川芎嗪在修复大鼠坐骨神经缺损方面有显著作用[40]，并在神经性疼痛方面有疗效[41]。赵红斌等[42]通过乳液交联法制备CBM加载川芎嗪，并与胶原蛋白混合制成神经导管，发现微球释放的川芎嗪可以促进间充质干细胞增殖和神经元特异性烯醇化酶表达，为进一步的动物神经诱导实验提供基础，但对于临床的适用性仍需要更多的研究和改良。

5 总结与展望

综上所述，CBM拥有可靠的负载生长因子、抗菌药等药物的能力，并且有可调控的缓释能力[43]。CBM还可以保护药物，减少环境改变对药物的影响，克服局部用药的局限性，也可避免部分药物并发症。壳聚糖可以混合不同的材料，例如明胶、海藻酸钠、PLGA等，并运用不同的技术制备出形态各异、功能不同的CBM。也因此，CBM的包封率相差较大，缓释效果也有差别。在CBM的制作工艺上，大部分方法都使用了有毒的有机溶剂，以及纳米级微球对人体可能存在潜在的毒害作用，且制备纳米级微球往往需要用到复杂的设备，这都不利于大规模的生产和临床应用。在口腔领域的基础研究已有一定的成果，在临床试验前，试剂还需要进一步研究，使其安全且便捷。CBM缓释系统中的药物定量研究较少，精准控释药物会是未来的研究方向。相信在不久的将来，通过技术改良，试剂研发以及技术之间的交叉应用，各种困难将会被逐一克服。