桑树内生菌的生物活性及应用前景

张锦锦，孙雨婷，郭烨，高文惠，韩俊华*，高林森*

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.河北省农林科学院农业信息与经济研究所，河北 石家庄 050051）

植物内生菌是指生活于健康宿主植物组织或器官内 部，不会对宿主植物引起明显病害的一类微生物群，包括真菌、细菌和放线菌[1]。自1993 年Stierle 等[2]首次从短叶红豆杉中分离到1 株能产生抗癌活性成分——紫杉醇的内生真菌以来，内生菌逐渐成为许多学科研究的热点，在农业、食品、医药领域展现出重要的开发价值和广阔的应用前景[3]。对内生菌进行研究，不仅能丰富紧缺药用资源材料，还能促进物种保护和可持续发展。

桑（Morus alba L.）为桑科桑属落叶乔木或灌木，属温带和亚热带植物，原产并广泛种植于中国中部和北部地区，是集食用、药用、饲用、观赏等于一体的生态经济型树种。桑树全身都是宝，上至桑枝、桑叶，下至桑蚕、沙僵蚕等，均具有巨大的药用价值。研究发现，桑叶含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖等，具有降脂、降血压、减肥等功效；桑葚含有花色苷、多酚类、微量元素等，具有抗氧化、抗癌、养颜美容等作用；桑枝含有鞣质、蔗糖、果糖以及丰富的纤维素、半纤维素等，具有清热、祛风、通经络等作用；桑白皮具有止咳平喘、利尿和降压的作用，并能治疗风湿麻木、糖尿病等症状；桑树中还含有丰富的黄酮类化合物、植物甾醇、有机酸等[4]。此外，桑树的生物碱含量较高，尤其是具有显著降血糖作用的1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）。桑内生菌在整个生命周期内都生活在桑树体内，与桑树形成互利共生的关系。桑树的各个组织器官在我们日常生活中发挥着重要作用，与其内生菌的作用密不可分[5]。

1 桑树内生菌的多样性

植物内生菌资源丰富、种类繁多，大部分植物体内含有多种内生菌。同一品种植物，不同季节、不同年龄、不同组织部位，其内生菌的种类也存在一定差异[6]。郑丽屏[7]从桑树根、茎、叶中共分离得到132 株内生菌，其中真菌106 株、细菌23 株、放线菌3 株，包括镰孢霉属、链格孢属、刺盘孢属等数十个属。Lukša 等[8]从白桑上分离出近百种内生菌，其中，细菌种群以Tatumella（塔特姆氏菌属）、明串珠菌属、Frateuria（弗拉德氏菌属）和假单胞菌属为主，真菌以Hanseniaspora（有孢汉生酵母属）、隐球菌属、枝孢菌属和Phoma（茎点霉属）为优势菌属。

内生菌的分离多采用组织分离法，消毒时选择不同浓度的乙醇、NaClO、HgCl 等溶液，通过对植物表面进行不同时间的浸泡，达到去除表面微生物的目的[9]。目前，内生菌的分离方法通常采用常规的分离培养，然而由于生长条件的限制，导致许多不可被常规培养的内生菌[10]被忽略。吴燕燕等[11]分别利用传统分离培养法和基于Illumina MiSeq 的高通量测序技术分析了桑树内生细菌的多样性，结果显示，通过高通量测序得到的菌群数量远远高于传统组织分离培养法，采用传统分离培养法会有大量不可培养的内生菌被忽略。Ting 等[12]也采用基于Illumina 的测序方法，对不同品种、不同季节的桑树内生细菌分布情况进行了研究，结果表明，不同品种的桑树，春季内生菌主要为变形杆菌门和放线菌门，秋季内生菌以变形杆菌门为主，核心菌属超过20 种，其中Pantoea（泛菌属）、Methylobaterium（甲基杆菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）的丰富度较高。近年来，从桑树不同部位分离到了许多种类的内生菌（表1）。

表1 桑树内生菌的种类Table 1 Species of endophytes in Mulberry

2 桑树内生菌的生物活性

内生菌为植物菌群的重要组成部分，已从多种植物中分离得到，其中一些菌种已在植物保护领域显示出巨大的应用潜力，如加速种子萌发、促进植物生长、提高肥料利用率等[33，34]。内生菌在与宿主植物和谐共生过程中产生的活性物质也是抗菌、降血糖、抗氧化等食品或药品开发的重要潜在资源。

2.1 抑菌活性

因病原菌导致的桑树病害大约有150 种，其中近30 种病害会对桑树造成严重生长发育不良、桑果产量低、桑果品质劣变等问题，如桑疫病、桑炭疽病、桑葚菌核病等。目前，桑树病害防控主要是利用化学药剂，但长期使用化学药剂会导致农药残留、抗药性等问题越来越凸显。研究表明，药用植物内生菌在某种程度上具有一定的抑菌活性[35]。近年来，利用内生菌进行生物防治已逐渐成为备受关注的植物防治新策略，展现出广泛的应用前景。

王若琳等[23]从桑树茎中分离到17 株内生细菌，并从中筛选出1 株对桑断枝烂叶病菌Boeremia exigua GXH1 具有显著拮抗作用的菌株——贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株对核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）等其他11 种病原菌具有不同程度的抑制作用，该研究为桑叶病害的生物防治提供了安全和有效途径。谢洁等[22]从健康的桑茎中分离得到1 株对桑葚核地杖菌具有显著拮抗作用的内生菌——特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis），该菌株的发酵液对桑葚核地杖菌的抑菌率高达100%，田间试验结果表明该菌株是开发桑葚菌核病生防制剂的理想菌株。桑树是蚕桑产业的重要物质基础，也是我国传统的药用植物，但目前桑树病害严重，因此寻找安全无害的治理方法是非常必要的。

2.2 产α-葡萄糖苷酶抑制剂

α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前治疗Ⅱ型糖尿病的常用药物，已广泛应用于糖尿病的治疗。DNJ 是一种有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有显著的降血糖作用。1976 年Yagi[36]首次从桑根皮中分离到天然DNJ，之后又在桑枝、桑叶以及其他植物中陆续发现。目前，桑枝、桑叶作为中药治疗糖尿病，已在我国临床上应用。

有研究报道，大多数药用植物内生菌能够产生与其宿主植物相同或相似的生物活性物质[37]。桑树是DNJ 含量很高的植物之一[32]，因此，从桑树中筛选能够产α-葡萄糖苷酶抑制剂的内生菌受到广泛关注。但截至目前，从桑树内生菌中筛选出产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株报道尚不多见。武婷婷等[25]从桑树的内生菌中筛选得到1 株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株S-J-X-4，初步判定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。叶晶晶[32]从桑树中分离得到2 株高产DNJ的内生菌——嗜麦芽寡养假单胞杆菌和藤黄微球菌，2 个菌株的发酵液提取物对α-葡萄糖苷酶均具有很好的抑制作用，且其中1 个菌株的发酵产物与DNJ 在降低糖尿病小鼠血糖和改善糖尿病症状方面表现出相同的效果[38]。郑丽屏等[13]从桑枝中分离得到1 株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的内生真菌SZ-2，经鉴定为链格孢属（Alternaria sp.），其菌丝多糖具有显著抑制α-葡萄糖苷酶的作用，有望成为新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。在该研究中，其还进一步探究了内生菌SZ-2 菌丝多糖的生物活性，发现内生菌次生代谢产物的生物活性与宿主植物次生代谢产物的生物活性一致。贾亚楠等[17]从桑枝中分离到内生假单胞菌，其代谢产物对α-葡萄糖苷酶也表现出一定的抑制作用，该研究也为利用桑树内生菌发酵生产天然降血糖药物提供了理论依据。骆丽如等[18]进一步对从桑树枝叶中分离得到的内生真菌及其利用桑叶粉末产生DNJ 的效果进行了研究，初步认为，该内生真菌在PDA 培养基中自身不能产生DNJ，但能将桑叶中的某些物质转化成DNJ，进而增加DNJ 含量。后续研究可以继续探讨桑树内生菌与DNJ 积累的关系，以明确桑树内生菌与桑叶组织或悬浮细胞共同培养是否可以提高内生菌的DNJ产量。目前国内外市场对DNJ的需求均处于供不应求的状态，上述研究也为提高DNJ 含量提供了新的研究思路和依据。

目前，国内外已有许多研究报道了利用微生物合成α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法[39～41]，但是利用桑树内生菌产α-葡萄糖苷酶抑制剂并用于临床治疗高血糖的方法仍有待深入研究，需要综合考虑菌株的安全性、DNJ 产率和提取成本等。

2.3 调节植物生长

植物内生菌对宿主植物的促生长作用主要表现在对植物种子萌发和生根生长的促进，对植物本身不造成损伤，且对环境友好。研究表明，部分植物内生细菌可以通过产生植物激素[42]、生物固氮作用、光合作用、合成铁载体[43，44]等，促进植物对氮、磷、钾、铁等矿物质的吸收，以及改善土壤微环境等方式促进植物生长。

Xu 等[24]从33 株桑内生拮抗菌中筛选出8 株内生细菌，并进行盆栽试验，结果表明，8 株供试内生菌对桑树幼苗生长均具有不同程度的促进作用。其中，1.0×107CFU/mL 芽孢杆菌菌液处理的桑树幼苗，芽长和根鲜重分别较未处理提高了83.37%和217.70%，表现出显著的促生长作用。从桑叶中获得的内生细菌洋葱伯克霍尔德Lu10-1 能够产生生长素，有助于磷的溶解和固氮酶活性的提高，能在桑树幼苗中快速、高效繁殖和传播，是一种高效的桑树幼苗生长促进剂[45]。从健康桑树茎中分离到的1 株内生芽孢杆菌sp.7PJ-16，通过合成吲哚-3-乙酸以及铁载体，表现出很强的促进植物生长的能力[46]。从健康桑树根中分离出的内生凝集泛菌SWg2 也能显著促进桑树幼苗生长，采用107CFU/mL 的SWg2 菌悬浮液浸种后，桑树种子发芽率和胚根长度分别提高了100%和144.2%[47]。高绘菊等先后从桑树中分离出内生细菌——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[9]和内生真菌——Macrophomina phaseolina[48]，其中一定浓度的枯草芽孢杆菌培养液能显著提高玉米和桑树种子的发芽率，明显增加植株鲜重，对2 种植物幼苗生长均具有明显的促进作用。可以看出，从桑叶、茎、根等不同部位分离到的内生菌，均对植株生长具有一定的促进作用。目前，我国市场上鲜有植物内生菌的生长促进剂，植物生长调节剂也多为仿制国外产品，品种较少且缺乏创新性。因此，开发新型、更安全、环保的植物生长促进剂和调节剂，将是一个新的契机和挑战。

2.4 抗氧化活性

桑树内生菌不仅在抑菌、促生长和降血糖方面倍受关注，其抗氧化能力也不容忽视。郑丽屏[7]研究报道，桑内生真菌产生的胞外多糖可以显著抑制乳酸脱氢酶活性，并维持过氧化物酶和过氧化氢酶活性，在降低细胞膜脂质过氧化和过氧化氢损伤方面表现出积极作用。贾亚楠等[17]也发现，桑内生假单胞菌的发酵液具有很强的清除ABTS 自由基和DPPH 自由基的活性。而柴建萍等[49]早在2009 年就已经从3 种桑树品种中分离得到了可以产黄酮类物质的内生真菌，其发酵培养液中黄酮类物质含量为0.01 mg/mL 左右。因此，内生菌生长过程中产生的多糖及黄酮类物质很可能是其抗氧化活性的主要原因。而且，已有罗汉果内生菌[50]、银杏内生菌[51]、五味子内生菌[52]、人参内生菌[53]、黄精内生菌[54]生长代谢中产胞外多糖、黄酮类化合物以及清除自由基、提高抗氧化能力的报道。内生菌抗氧化物质的产生与内生菌的特殊生境有关。对内生菌抗氧化活性以及产生的多糖类和黄酮类物质进行深入研究，将为开发新型保健食品或药品等提供研究基础和思路。

2.5 产油脂类物质

窦学娥等[48]从桑树根系中分离到1 株内生真菌Macrophomina phaseolina，该菌株的菌丝及菌核内均可累积大量油脂类物质，且可以利用纤维素生长，营养要求简单。该菌株菌体含油量高，易于纯化，且单不饱和脂肪酸含量较高。这对微生物油脂的产业化开发及应用具有重要意义，并且该菌株的纤维素降解能力也为进一步利用微生物转化秸秆生产油脂奠定了坚实基础。在核桃内生细菌和马尾松内生真菌中均发现了油脂类代谢产物，这也是内生菌与宿主长期共生、相互影响的结果。

3 桑树内生菌的应用前景

国内外研究均显示，桑树内生菌作为一种新型微生物资源具有很高的研究和应用价值，在环境、食品和医药等领域具有潜在的应用前景，预计未来的研究及开发应用将主要围绕以下2 个方面进行：

3.1 桑树病害防治及果蔬采后保鲜剂开发

桑树在生长过程中会受到多种真菌、细菌等病原微生物的侵染而引发病害，严重病害不仅威胁林业的可持续发展，也给蚕业、桑果产业造成巨大的经济损失。目前，对桑树病害的防控主要采取施用化学农药和种植抗性品种的方法。然而，与之相关的问题是抗药性增加、农药残留、环境污染、抗性品种选育周期长等，且产品性质也很难完全满足实际生产的需要。因此，寻找新的安全环保的生物防治方法来预防和控制桑树病害迫在眉睫。

近年来，桑树内生菌的研究多集中在内生菌的分离和拮抗菌的筛选上，拮抗内生菌的菌群数量不断扩大，多种内生菌对桑树致病菌表现出显著的抑制效果，如桑树内生细菌B.tequilensis 7PJ-16 对桑葚核地杖菌[22]、B.velezensis NPJ13 对桑断枝烂叶病菌表现出显著的拮抗作用[5]。但目前大量研究更多的是停留在针对内生菌发酵液粗提物质的活性分析上，缺乏对具体有效成分的提纯、结构鉴定、作用机理等深入探讨。未来研究应在筛选有益内生菌的基础上，探讨内生菌及其产生的抑菌物质的结构与特性、使用方式、安全性等，将内生菌应用于开发生物农药或生物保鲜剂中，使其真正应用于桑树病害防治以及果蔬的采后保鲜中。

3.2 DNJ 发酵生产及降糖药物开发

桑树为重要的中药材，含有多种活性成分，对桑树内生菌代谢产物进行深入研究可能为新药的研究和开发带来新契机。桑叶为降血糖药物的新来源，其产降血糖物质DNJ 的研究仍然是目前关注的热点。然而，目前已报道的从桑树中筛选出的产DNJ 的内生菌还不适用于食品和医药中[32]。因此，桑树内生菌在开发天然降糖药物方面的研究还需要进一步深入，如内生菌安全菌株的筛选、内生菌对DNJ 生物转化的机制、产DNJ 的发酵培养基及发酵条件优化、DNJ 的高效提取技术等，这些工作的深入开展将为实现微生物法生产DNJ 提供坚实可靠的理论基础。

4 展望

桑树为药食同源树种，其内生菌资源丰富，对于食用、药用等资源的开发是一个拥有巨大潜力的宝库。目前，桑树内生菌抗菌活性、产DNJ 的有关研究均表明其开发潜力巨大，但对其内生菌的研究还处于探索阶段，多限于对桑内生菌的分离鉴定以及对致病菌拮抗作用的研究，还存在内生菌资源利用不足、研究领域有限、研究方法单一、具体作用机制（生物转化途径、与宿主的相互关系等）尚不明确等问题。桑内生菌作为生物防治、果蔬采后保鲜、抗氧化以及降糖药物开发的重要潜在用途尚需要进一步探究，未来还应重视内生菌安全性及其与宿主之间关系和作用机理的研究。

随着现代研究技术的不断发展，在内生菌研究中新研究工具和手段的应用，将提升内生菌研究的整体水平，如利用高通量测序技术与传统培养分离相结合，充分挖掘桑树内生菌资源；通过内生菌的全基因组测序、代谢组及转录组研究，准确鉴定相关代谢通路的基因或关键酶，为桑树内生菌资源开发和利用提供基因信息。深入和系统研究内生菌，将会为内生菌的应用带来新的契机，也会为桑蚕经济、食品安全以及人类健康等创造更大的利益。