沙棘叶多酚的分离纯化及其活性分析

武海丽，杜锦娥，路洋洋，李汉卿，张晟 ，李卓玉

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.特色植物资源研究与利用山西省重点实验室，山西 太原 030006；3.山西大学 生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006）

0 引言

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是胡颓子科沙棘属落叶性灌木或小乔木，我国沙棘原地栽培面积占全球栽培量的90%以上［1］。沙棘的各个部位均蕴含有大量生物活性物质，如多种氨基酸、甾醇类、黄酮类、多酚类物质等。已有研究表明，沙棘叶中所含有的活性物质在抗肿瘤、清除体内自由基和调节免疫系统功能等方面具有功能，进而可用于防治部分慢性疾病［2-4］。沙棘中所含的多酚类化合物具有一定的抗氧化效果，能直接清除多种自由基。Elga等人比较了沙棘不同部位的抗氧化活性。结果表明，较于其他部位，沙棘叶表现出明显的抗氧化作用［5］。此外，Upadhyay等研究发现沙棘叶提取物有清除自由基的效果，并用总抗氧化能力测定法，证明了其抗氧化作用［6］。沙棘叶中的提取物能够提高免疫功能。金钟研究发现，沙棘叶中的黄酮类化合物能够提高小鼠肠道黏膜中IL-2和IL-4的表达，导致肠道免疫细胞的活性上升［7］。近年来的研究表明，沙棘叶中所含的黄酮类物质能使多种肿瘤细胞的生长受到抑制，表现出良好的抗肿瘤作用。Kim等人发现沙棘叶提取物可以降低ROS的基础水平，进而抑制C6神经胶质瘤细胞的增殖，并通过促进Bax的表达促进胶质瘤细胞凋亡［8］。

多酚类物质，是指分子结构中含多个酚羟基的植物成分，包括黄酮类化合物、多酚类化合物和水解单宁等［9］。根据结合方式的不同，植物多酚可分为自由酚/游离酚和结合酚［10］。自由酚是指能够溶于水或非极性溶剂的酚类，而结合酚则多指以糖苷键、酯键、醚苷键等结合蛋白质和纤维素等不溶性的一类多酚［11］，需采用碱、酸或酶降解的方式进行提取。国内外学者研究发现沙棘果和叶中的多酚类物质占沙棘总多酚的绝大部分，其中沙棘叶中所含的多酚类物质是果实中的十多倍［12］。目前，对沙棘叶中自由酚的提取和其药理作用研究较多，但对沙棘叶中结合酚的组成和功能研究较少。以往的研究表明，结合酚经肠道菌群发酵后比自由酚具有更强的生物活性［13］。因此，本研究以沙棘叶为研究对象，对其中的自由酚和结合酚进行分离、纯化，并检测其在抑制肿瘤细胞增殖中的作用，以期促进我省野生沙棘资源的深度开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

新鲜中国沙棘叶采自山西吕梁，清洗后晾干保存；MTT（5-二苯基四氮唑溴盐）于北京索莱宝科技公司购买；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）、乙醇（Ethyl Alcohol）、氢氧化钠（Sodium hydroxide）、浓盐酸（Concentrated hydro⁃chloric acid）、乙酸乙酯（Ethyl acetate）、福林酚试 剂（Folin-Ciocalteu）、SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸钠）、BSA（Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白。1 μg/μL）、没食子酸、胰蛋白酶购买自碧云天生物技术公司。

1.2 沙棘叶中自由态多酚及结合态多酚的提取

称取10 g沙棘叶并粉碎，按照料液比1∶10（W/V）分别加入超纯水及80%（V/V）的不同有机溶剂：乙酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮，置于4 ℃搅拌40 min，5000 r/min低温离心10 min后收集残渣，如此重复2次，合并两次所得的上清液，旋转蒸发进行浓缩，此步收集的为自由态多酚。将提取自由态多酚后所得的残渣分成两份，分别采用酸（甲醇：硫酸=1∶10，V/V）或碱（2 mol/L 氢氧化钠）室温水解24 h，然后将pH调至中性，多次加入相同体积的乙酸乙酯脱脂，离心后吸取水相得到的为结合态多酚，提取过程如图1。

1.3 总酚含量测定

总酚含量用福林酚比色法测定［14］。对于标准曲线，分别将标准品没食子酸用超纯水以0、20、60、100、150、200、300、400、500 和 600 μg/mL的浓度梯度制备成终体积为0.5 mL的标准液；对于待测样品，另取一支试管，加入0.1 mL样品和0.4 mL超纯水，同样使得终体积为0.5 mL。随后上述各试管再加入0.1 mL的Folin-Ciocalteu试剂于室温放置6 min。接着加入1 mL 7% Na2CO3试剂（W/V）和0.8 mL超纯水，混匀静置，90 min后用紫外-可见分光光度计在760 nm处测定并记录吸光度值（optical density，OD值）。

1.4 黄酮含量测定

黄酮含量用硝酸铝显色法测定［15］。对于标准曲线，分别将标准品芦丁配制成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和 0.6 mL 的标准液；对于待测样品，另取一支试管，加入0.1 mL样品，用超纯水补齐体积到0.6 mL，然后加入质量体积百分比为 5% 亚硝酸钠和 10% AlCl3‘H2O（W/V）各0.1 mL，静置6 min后再加入1 mL的4% 氢氧化钠（W/V），反应15 min后于510 nm处测定其OD值。

1.5 单宁含量测定

单宁含量用香草醛法测定［16］。分别在0、80、160、240、320和 400 μg/mL 的儿茶素标准溶液及待测样品中加入1.5 mL 4 %的香草醛（V/V）及0.75 mL的浓盐酸，室温避光静置15 min后，用紫外-可见分光光度计于500 nm处测定并记录其OD值。

1.6 大孔树脂纯化多酚

选择三种不同极性的大孔树脂HPD500、HPD600和HPD722对沙棘叶多酚进行初步纯化，各大孔树脂的功能参数如表1所示。对于新的大孔树脂，首先采用无水乙醇充分浸泡一天后，再使用超纯水清洗，直至洗出液澄清且无乙醇味为止。

然后将适量多酚提取物与大孔树脂置于锥形瓶中，为使多酚与大孔树脂充分结合，将锥形瓶放入摇床，150 r/min过夜振荡。将多酚-大孔树脂复合物转移至50 mL离心管，离心收集上清，即为平衡液；对于沉淀，首先用超纯水冲洗去除未吸附的多酚，然后使用不同浓度梯度的乙醇洗脱大孔树脂，收集得到梯度洗脱液，并根据以下公式计算吸附量（Q）与解析率（D）。其中，Q：吸附量（mg/g）；D：解吸率（%）；C0：起始浓度（mg/mL）；C1：平衡液浓度（mg/mL）；V1：吸附液体积（mL）；W：树脂重量（g）；C2：解吸液中多酚含量（mg/mL）；V2：解吸液体积（mL）。

1.7 细胞培养及MTT法测定细胞活力

人结肠癌细胞HCT-116用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，并放于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。MTT法参照标准的方法并进行改进［17］，HCT-116以每孔 6×103个细胞的密度进行孵育，待其贴壁后，用不同浓度的多酚以时间梯度为24 h、48 h进行处理。此后，在96孔板的细胞中加入20 μL包含5 mg/mL MTT的培养基，并放于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中，继续培养4 h。弃除培养基后加入150 uL的DMSO。用摇板机震荡混匀后，使用酶标仪（型号为Infinite F50），在570 nm处测定其吸光度。细胞存活率通过公式计算：（OD570-处理组/OD570-对照组）×100%。

1.8 数据统计分析

数据来源于3次以上重复实验，并用平均值±标准差（Mean±SD）表示；在SPSS 19.0软件中采用t检验进行差异分析。

2 结果

2.1 各溶剂对沙棘叶自由态多酚含量的提取差异

分别绘制标准品没食子酸、芦丁、儿茶素的标准曲线（图2），并根据各标准曲线计算不同溶剂所提取的沙棘叶中总多酚、黄酮和缩合单宁的含量。

由表2可知，提取得到的总酚含量依次为：80%甲醇 > 80%乙醇 > 80% 乙酸乙酯 >80% 丙酮 > 超纯水。各溶剂得到的黄酮含量依次为：80%甲醇 > 80%乙醇 > 80% 乙酸乙酯 > 80% 超纯水 > 80% 丙酮。此外，不同溶剂提取得到的黄酮含量差异较大，结果表明80 %甲醇提取得到的黄酮含量最多（300.96±16.85） mg/10 g，丙 酮 中 含 量 最 少（144.17±5.38） mg/10 g。用香草醛法测得，不同溶剂提取的沙棘叶中的单宁含量依次为：80% 甲醇 > 80% 乙 醇> 80% 乙酸乙酯 > 80% 丙酮 > 超纯水，与各溶剂提取的沙棘叶中总多酚含量顺序一致。

2.2 不同提取溶剂对沙棘叶自由态多酚抑制结肠癌细胞增殖的影响

采用MTT实验检测了不同溶剂提取沙棘叶自由态多酚对癌细胞增殖的影响。研究结果显示，提取自不同溶剂中的沙棘叶自由态多酚对HCT-116细胞的增殖抑制作用表现出剂量依赖性。其中80%甲醇和80%丙酮提取的沙棘叶自由态多酚对HCT-116细胞生长抑制效果较好，而超纯水和80%乙酸乙酯提取的沙棘叶自由态多酚对细胞生长抑制效果较差（图3）。

2.3 不同水解法对沙棘叶结合态多酚提取率的影响

根据以上结果可以看出，80%甲醇提取得到的自由酚的含量及抑制细胞增殖的能力均高于其他四种溶剂，因此将其提取自由酚后的残渣分别采用碱水解和酸水解进行结合态多酚的提取。比较二者得到的沙棘叶中结合态多酚类的含量差异，结果显示采用碱水解提取得到的结合态总酚、黄酮、单宁含量分别是酸水解中的1.6、3.9和3.3倍，表明碱水解法为沙棘叶结合酚的更优提取方法。

2.4 不同浓度的沙棘叶结合态多酚对肿瘤细胞活力的影响

比较两种水解方法得到的沙棘叶结合酚对结肠癌细胞增殖的影响，发现二者以浓度依赖的方式抑制HCT-116细胞的增殖，且碱水解法的抑制作用显著优于酸水解法（图4）。

2.5 沙棘叶结合态多酚抗肿瘤活性成分的纯化

为了得到较纯的抑制癌细胞生长的活性成分，首先，采用HPD500、HPD600和HPD722这3种不同极性的大孔树脂对沙棘叶结合态多酚进行分离纯化，并计算其吸附率和解析率。结果显示，大孔树脂HPD500的吸附率最高，而HPD600的解析率最高，HPD722的吸附率和解析率均最低（图5（a）和5（b））。对纯化得到的多酚物质进行抗肿瘤活性评价，发现3种大孔树脂的洗脱液均具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，并且表现出良好的浓度依赖性抑制作用（图5（c））。多酚活性成分在大孔树脂中的吸附能力及其解离能力对于后续多酚的含量均具有较大影响。因此，综合考虑大孔树脂的吸附率和解析率及对肿瘤细胞生长抑制活性，我们选取HPD600进行后续的纯化实验。

进一步分别采用30%、60%、95%（V/V）的乙醇对吸附在大孔树脂的沙棘叶结合态多酚进行洗脱，检测各洗脱液对肿瘤细胞生长的抑制活性，发现30%和60%的乙醇洗脱液均能够显著抑制结肠癌细胞的增殖，其中60%的乙醇洗脱液的抑制作用略优于30%的乙醇洗脱液（图5（d））。此外，95%的乙醇洗脱液中几乎未检测到多酚含量，表明60%的乙醇可洗脱大部分多酚。

3 讨论

不同溶剂对不同的植物多酚类物质的提取效率有较大影响，因而选择恰当的提取溶剂至关重要。本研究比较了5种不同的溶剂对沙棘叶游离态总酚、总黄酮和缩合单宁的提取能力，发现80%的甲醇较其他几种溶剂对沙棘叶中总酚、总黄酮和缩合单宁的提取效果最好。因此，甲醇水混合物是一种高效提取沙棘叶游离酚的溶剂。

植物多酚有两种不同的存在方式，即自由态多酚与结合态多酚。其中自由态多酚可由溶剂萃取，而结合态多酚无法直接被溶剂萃取，需要通过酶法、酸水解和碱水解等方法获得。本研究比较了酸水解和碱水解对沙棘叶中结合酚的提取效果，发现碱水解法获得的其总酚、总黄酮和水解单宁含量均较酸水解法含量髙。因此，相对于酸水解法而言，碱水解法更适于提取沙棘叶中的结合态多酚。

研究表明大约有24%～57%的多酚类化合物在果蔬中以结合态形式存在［11］。显然，仅仅对自由态多酚进行研究而忽略结合态多酚的功效，导致多酚化合物的抗氧化、抗肿瘤等的效应大大低估。而且提取游离多酚后的残渣中含有结合态多酚，在消化系统消化吸收后依然能保持相对完整的结构，并且能够在结肠等各个器官都能发挥其抗炎、抗癌和抗菌等作用。然而，游离态多酚的化学结构大多在消化吸收后被破坏，导致其生物活性和利用率较低［18］。本研究分别比较了不同溶剂提取得到的游离酚及结合酚对肿瘤细胞的抑制活性，发现沙棘叶中的结合态多酚具有较强的抑制结肠癌细胞生长的作用，表明结合酚具有更强的生物活性。

综上所述，本文建立了沙棘叶中结合态多酚和游离态多酚的提取方法，并证明结合态多酚具有良好的抑制结肠癌细胞增殖的活性，但其发挥抗肿瘤活性的有效成分还有待深入研究。本研究的开展为将来沙棘叶这一资源的深度开发提供基础。