一种用于过氧亚硝酸根检测的长波长发射比率荧光探针

杨倩倩，昝琪，王硕航，于雪，张跃伟*，董川，樊丽*

（1.山西大学 环境科学研究所，山西 太原 030006；2.吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

0 引言

过氧亚硝酸根（ONOO−）是生物体内一类重要的活性氧化物（ROS）和活性氮化物（RNS），由超氧阴离子自由基（O2∙ˉ）和一氧化氮自由基（∙NO）反应形成，参与各种生理和病理过程的调节［1-2］。ONOOˉ不仅可以起到信号传导的作用，还具有抗菌活性，而且在维持细胞内氧化还原稳态方面发挥重要作用［3-4］。然而，由于ONOOˉ具有较强的氧化性和亲核性，过量的ONOOˉ易与蛋白质、核酸、脂质、酪氨酸残基和酶等多种生物活性物质发生反应，从而影响细胞正常的生理活动，甚至导致细胞凋亡或坏死，进而诱发多种疾病，如炎症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症等［5-7］。为了更好地研究ONOOˉ水平与相关疾病之间的内在联系，迫切需要开发一种用于特异性检测ONOOˉ的方法。

迄今为止，文献报道了多种检测ONOOˉ的方法，包括电化学分析法、色谱法、紫外-可见分光光度法等［8-10］，但是这些检测方法普遍存在一些局限性，如灵敏度低、操作费时、设备昂贵、检测成本高、样品预处理具有潜在破坏性等。相对而言，基于小分子荧光探针的荧光成像技术，因其灵敏度高、便于操作、成本较低、非破坏性检测和时空分辨率高等优势，已成为检测生物系统内活性物质的有力工具，在现代生物学和医学研究领域不可或缺［11-13］。目前，在已开发用于ONOOˉ检测的荧光探针中，根据识别机理的不同，可分为硼酸及硼酸酯氧化型［14-17］、C=C 双键裂解型［18-20］、三氟甲基活化酮型［21-22］、有机硒/碲氧化型［23-24］、α-酮酰胺氧化型［25］、酰肼氧化型［26-27］以及 N-氨基苯酚氧化型［4，28］等。尽管这些荧光探针对于人们理解ONOOˉ的生理学功能及其与相关疾病关系方面具有极大的帮助，但所报道的ONOOˉ荧光探针大多都是单波长发射探针，易受到如探针的局部浓度、仪器参数和微环境等外界因素的干扰［29-30］，检测的准确度受到限制。相反，比率发射型荧光探针通过测量两个不同发射波长的荧光强度的比值，可以有效避免上述干扰，从而能够在复杂的环境中更准确地分析目标分析物［13，18］。 此 外 ，目 前 报 道 的 许 多 比 率 型ONOOˉ荧光探针仍存在发射波长短（< 600 nm）、易受其他活性氧（如 H2O2、ClOˉ、·OH、1O2等）干扰导致的选择性差等问题［22，31］。因此，迫切需要开发具有长波长发射、高选择性的比率型荧光探针用于ONOOˉ的特异性识别。

本文设计合成了一种长波长发射的比率型荧光探针DHX--BE用于ONOOˉ的检测，DHX--BE由苯硼酸酯、氧杂蒽以及吡啶阳离子构成，利用苯硼酸酯和碳碳双键两个反应位点对ONOOˉ进行识别（图1）。DHX--BE本身在658 nm处具有深红荧光发射，与ONOOˉ作用后，红色荧光减弱；同时在554 nm处产生强绿色荧光发射，发射峰位移高达104 nm。DHX--BE对ONOOˉ的响应呈现显著的比率发射荧光特性，其荧光强度比值（F554nm/F658nm）增强了727倍，检测限为20.4 nmol/L。此外，DHX--BE对ONOOˉ具有较快的响应速度和高选择性，从而实现了对ONOOˉ的快速、高效和特异性检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

2-溴-1-环己烯-1-甲醛、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛购于上海麦克林生化科技有限公司。碳酸铯、醋酸锌、1，4-二甲基吡啶碘化物、三氯化铝购于阿拉丁试剂（上海）有限公司。4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯购于萨恩化学技术（上海）有限公司。除另有说明，所用的化学试剂均为分析纯，在实验使用时未做进一步处理。

紫外-可见吸收光谱在TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司，中国）上测定；荧光光谱在FLS920爱丁堡荧光光谱仪（爱丁堡仪器公司，英国）上测定；核磁共振光谱在Bruker AVANCE III 600 MHz超导核磁共振波谱仪（布鲁克公司，瑞士）上测定；高分辨质谱在Thermo Scientific Q Exac⁃tive组合型四极杆Orbitrap质谱仪（赛默飞世尔科技公司，美国）上测定。

1.2 探针的合成与表征

探针DHX--BE的合成路线如图2所示。

1.2.1 化合物2的合成

向2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（402 mg，2.645 mmol）的 N，N-二甲基甲酰胺（10 mL）溶液中加入碳酸铯（2585 mg，7.935 mmol），氮气保护下，再将2-溴-1-环己烯-1-甲醛（化合物1，1000 mg，5.29 mmol）的N，N-二甲基甲酰胺（2 mL）溶液滴加到上述反应液中。室温反应24小时后，将反应液倒入蒸馏水（120 mL）中，用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，收集有机相，氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩。经过快速柱层析纯化（石油醚∶乙酸乙酯 = 5∶1，V/V），真空干燥后得到黄色固体223 mg为化合 物 2，产 率 为 34.8%。1H NMR （400 MHz，CDCl3） δ 10.32 （s， 1H）， 7.08 （d， J = 9.2 Hz，1H）， 6.72 ～ 6.61 （m， 3H）， 3.85 （s， 3H），2.72 ～ 2.52 （m， 2H）， 2.45 （t， J = 6.0 Hz，2H）， 1.76 ～ 1.67（m， 2H）。

1.2.2 化合物3的合成

将化合物 2（171 mg，0.7 mmol），1， 4-二甲基吡啶碘化物（165 mg，1.54 mmol）和醋酸锌（333 mg，1.82 mmol）加入到乙醇（10 mL）中，然后加入哌啶（190 μL）为催化剂。氮气保护下，80 ℃反应27 h后，冷却至室温，浓缩反应溶液，残余物经过快速柱层析纯化（二氯甲烷∶甲醇 = 100∶1，V/V），真空干燥后得到紫黑色固体202 mg为化合物3，产率为62.3%。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.63 （d， J = 6.8 Hz，2H）， 8.24 （d， J = 16.0 Hz， 1H）， 8.07 （d，J = 6.4 Hz， 2H）， 7.23 （d， J = 8.4 Hz， 1H），7.00 （d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.78 （s， 1H）， 6.73（dd， J = 8.4， 2.0 Hz， 1H）， 6.63 （d， J = 16.0 Hz， 1H）， 4.18 （s， 3H）， 3.84 （s， 3H）， 3.03（s， 1H）， 2.56 （t， J = 5.2 Hz， 2H）， 1.85 ～1.72（m， 2H）， 1.68 ～ 1.62（m， 1H）。

1.2.3 化合物4的合成

在冰水浴条件下，将化合物3（500 mg，1.09 mmol）加入到100 mL圆底烧瓶中，再加入干燥的二氯甲烷（20 mL）使化合物3全溶。氮气保护下，加入三氯化铝（2907 mg，21.8 mmol），自然升至25 ℃并反应24 h。反应完全后，缓慢加入蒸馏水（20 mL）淬灭反应，然后再加入1 mol/L HCl（30 mL），用二氯甲烷∶甲醇 = 10∶1（3×50 mL）萃取，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩。经过快速柱层析纯化（二氯甲烷∶甲醇 =20∶1，V/V），真空干燥后得到紫黑色固体436 mg为化合物4，产率为89.9%。1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 10.25 （s， 1H）， 8.63 （d，J = 6.8 Hz， 2H）， 8.21 （d， J = 15.6 Hz，1H）， 8.05 （d， J = 7.2 Hz， 2H）， 7.11 （d， J =8.4 Hz， 1H）， 6.80 （d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.76（s， 1H）， 6.63 ～ 6.55 （m， 2H）， 4.17 （s，3H）， 4.14 （q， J = 5.6 Hz， 2H）， 2.56 ～ 2.52（m， 2H）， 2.49 ～ 2.25（m， 2H）.

1.2.4 探针DHX--BE的合成

将化合物 4（30 mg，0.05 mmol）溶于甲醇（3 mL）中，加入碳酸铯（49 mg，0.15 mmol）反应10 min，然后加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯（45 mg，0.15 mmol）。氮气保护下，80 ℃反应18 h后，浓缩反应液，残余物经过快速柱层析纯化（二氯甲烷∶甲醇 = 50∶1，V/V），真空干燥后得到紫黑色金属光泽固体15 mg为目标产物DHX--BE，产率为 45.4%。1H NMR （400 MHz，DMSO-d6） δ 8.63 （d， J = 6.8 Hz， 2H）， 8.24（d， J = 16.0 Hz， 1H）， 8.07 （d， J = 6.8 Hz，2H）， 7.72 （d， J = 8.0 Hz， 2H）， 7.48 （d， J =8.0 Hz， 2H）， 7.24 （d， J = 8.4 Hz， 1H）， 7.10（d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.81 （dd， J = 8.8， 2.4 Hz， 1H）， 6.79 （s， 1H）， 6.64 （d， J = 16.0 Hz， 1H）， 5.22 （s， 2H）， 4.17 （s， 3H）， 2.56（t， J = 5.2 Hz， 2H）， 2.49 ～ 2.46 （m， 2H），1.80 ～ 1.70 （m， 2H）， 1.30 （s， 12H）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 159.65， 153.35，152.92， 152.24， 144.11， 139.93， 134.96，134.59， 127.41， 127.11， 126.81， 124.60，122.15， 118.40， 115.17， 110.70， 101.94， 83.69，69.38， 46.22， 30.93， 28.78， 24.66， 24.03， 22.04，20.30， 13.94； HR-MS m/z： C34H37BNO4+， calcd 534.281 0，found 534.281 0。

1.3 光谱测定

1.3.1 探针DHX--BE母液的制备

精确称取一定质量的DHX--BE固体，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成1 mmol/L的DHX--BE母液。

1.3.2 ONOOˉ的制备

ONOOˉ的具体制备过程参考文献［32］，得到的储备液需在−20 ℃保存。ONOOˉ的浓度通过吸收光谱在302 nm处的吸光度值计算确定（摩尔吸光系数为 1670 L∙mol-1∙cm-1）。

1.3.3 分析测试物的制备

过氧化氢（H2O2）用去离子水稀释30%H2O2溶液制得；次氯酸根（ClOˉ）用去离子水稀释NaClO（含6%～14%活性氯）溶液制得，其浓度由292 nm处的吸光度值确定（摩尔吸光系数为 350 L∙mol−1∙cm−1）；羟基自由基（·OH）依据芬顿反应产生，由硫酸亚铁溶液加入10当量的H2O2溶液反应得到，其浓度等于Fe2+浓度；单线态氧（1O2）由次氯酸钠溶液与H2O2溶液反应制得，其浓度等于次氯酸钠的浓度；一氧化氮（NO）是由硝普钠溶于去离子水中制成10 mmol/L的储备液；其他生物硫醇、阳离子和阴离子均溶于去离子水中制成10 mmol/L储备液。

1.3.4 探针DHX--BE的光谱性能测试

取10 μL DHX--BE母液（1 mmol/L）加入到2 mL DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 7.4）测试体系中，混合均匀后，再加入不同浓度的ONOOˉ溶液，室温下反应5 min后，进行紫外-可见吸收光谱和荧光光谱的测定。

选择性实验中，取10 μL DHX--BE母液加入2 mL DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 7.4）测试体系中，混合均匀后，再加入20 μL其他分析物（10 mmol/L），室温下反应5 min后，进行荧光光谱的测定。

pH响应实验中，取10 μLDHX--BE母液加入 2 mL DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 3−10）测试体系中，加或不加100 μmol/L ONOOˉ条件下，室温下反应5 min后，进行荧光光谱的测定。

以上实验中，激发波长均为514 nm，激发和发射狭缝均为3 nm。

2 结果与讨论

2.1 探针DHX--BE对ONOOˉ的光谱响应研究

首先，我们研究了DHX--BE在DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 7.4）体系中与 ONOOˉ反应前后的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。如图 3（a）和 3（b）所示，DHX--BE 本身在 520 nm处有最大吸收和在658 nm处有最大发射。当加入ONOOˉ后，DHX--BE在520 nm处的吸收强度明显减弱，同时在362 nm处有新的吸收峰出现。另外，在ONOOˉ的存在下，DHX--BE在658 nm处的发射峰消失，同时在554 nm处出现一个新的强荧光发射峰，这说明DHX--BE与ONOOˉ发生反应并且生成了新物质。以上结果均表明，DHX--BE可以与ONOOˉ发生反应且能通过比率响应来特异性的识别ONOOˉ。

2.2 探针DHX--BE对ONOOˉ的响应时间研究

为了更好地理解DHX--BE与ONOOˉ的反应动力学，在室温下考察了DHX--BE对ONOOˉ的响应时间。如图4（a）所示，DHX--BE本身在658 nm处的荧光强度在几分钟内保持不变，在加入ONOOˉ后，658 nm处的荧光强度降低，同时在554 nm处出现新的荧光发射峰且其发射强度随着反应时间的延长而不断增强，在反应5 min后达到最大值。DHX--BE的荧光强度比F554nm/F658nm随时间的变化如图4（b）所示，在加入ONOOˉ后，F554nm/F658nm逐渐增大，在反应5 min后达到最大值，这表明DHX--BE与ONOOˉ在5 min内反应完全。

2.3 探针DHX--BE对ONOOˉ的荧光滴定研究

随后，对DHX--BE与ONOOˉ反应的荧光光谱实验进行了研究。如图5（a）所示，随着ONOOˉ浓度的逐渐增加，DHX--BE在658 nm处的荧光强度逐渐降低，同时一个新的荧光发射峰在554 nm处出现且荧光强度随着ONOOˉ浓度的增加而逐渐增强。荧光强度比F554nm/F658nm随ONOOˉ浓度增加的变化如图5（a）插图所示，当ONOOˉ的浓度增加到100 μmol/L时，F554nm/F658nm从0.031 41增加至22.83，增强了727倍。进一步分析DHX--BE的荧光强度比F554nm/F658nm和ONOOˉ浓度的线性关系，如图5（b）所示，在ONOOˉ浓度范围为0～10 μmol/L时，F554nm/F658nm与ONOOˉ浓度具有良好的线性关系（F554nm/F658nm= 0.062 3 c （ONOOˉ） + 0.017 3，R2=0.998）；根据 LOD = 3σ/k，计算得到 DHX--BE对ONOOˉ的检出限为20.4 nmol/L。上述结果表明，DHX--BE对ONOOˉ具有较高的灵敏度而且可以用于ONOOˉ的定量检测。

2.4 探针DHX--BE对ONOOˉ的选择性研究

接下来，考察了DHX--BE对ONOOˉ的选择性。在相同体系中，当加入ONOOˉ或其他分析物时，DHX--BE的荧光光谱变化和荧光强度比F554nm/F658nm变化如图 6（a）和 6（c）所示。这些分析物包括各种活性氧（H2O2、ClO-、·OH、1O2）、活性硫（S2-、HSO3ˉ、S2O32-、GSH、Hcy、Cys）、活 性 氮（NO、NO2ˉ）以及各种阳离子（K+、Na+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cd2+、Sn2+）和阴离子（Cl-、Br-、CO32-、H2PO4ˉ），它们分别与DHX--BE反应5 min后进行检测。结果表明，只有在加入ONOOˉ时，554 nm处才会出现新的强荧光发射峰，F554nm/F658nm才会显著增加，而加入其他分析物与探针本身相比几乎没有变化，产生的影响几乎可以忽略不计。此外，我们还研究了在上述分析物存在时，DHX--BE对ONOOˉ识别的抗干扰能力。如图6（b）所示，当ONOOˉ和其他分析物共存时，DHX--BE在554 nm处都保持了较强的荧光强度，且其荧光强度比F554nm/F658nm也几乎没有明显变化（图6（c））。这些结果充分证实了DHX--BE对ONOOˉ具有高度选择性，可以在复杂的生物体系中高灵敏的检测ONOOˉ。

2.5 探针DHX--BE对ONOOˉ的pH响应研究

进一步研究了DHX--BE在不同pH条件下对ONOOˉ的响应。如图7所示，DHX--BE本身的荧光强度比F554nm/F658nm在pH 3～10范围内基本没有变化，表明DHX--BE具有良好的稳定性。当加入ONOOˉ反应5 min后，荧光强度比F554nm/F658nm在pH 3～6范围内无明显变化；而在7～10的pH范围内显著增大，尤其在pH 7.4时，荧光强度比F554nm/F658nm达到最大，这表明DHX--BE非常适合在生理pH环境下对ONOOˉ进行特异性识别。

2.6 探针DHX--BE对ONOOˉ的响应机理研究

由于ONOOˉ具有强氧化性，能够氧化苯硼酸酯和碳碳双键［13］。通过DHX--BE与ONOOˉ反应前后的荧光光谱对比，我们推测ONOOˉ有可能与DHX--BE的苯硼酸酯和碳碳双键作用，使苯硼酸酯发生氧化水解反应生成酚类化合物，同时诱导碳碳双键氧化裂解得到相应的醛，最终释放出产物DHX--OH（图1）。为了进一步证实上述推断，我们对DHX--BE和DHX--BE与ONOOˉ反应后的产物进行了高分辨质谱分析。如图8所示，DHX--BE在m/z =534.281 0处有较强的分子离子峰，与DHX--BE的分子量（534.281 0）吻合。与ONOOˉ反应后，在m/z =229.140 6出现一个新的分子离子峰，这与推测的产物DHX--OH（m/z：229.085 9，［M+H］+）相对应。由此表明，ONOOˉ可以氧化水解DHX--BE的苯硼酸酯，同时氧化裂解碳碳双键，生成产物分子DHX--OH。

3 结论

本文设计合成了一种长波长发射的比率型荧光探针DHX--BE，利用苯硼酸酯和碳碳双键作为ONOOˉ的特异性反应位点，用于ONOOˉ的检测。通过核磁共振波谱和高分辨质谱对DHX--BE的结构进行了表征；采用紫外-可见分光光度法和荧光光谱法研究了DHX--BE对ONOOˉ的特异性识别；并且通过高分辨质谱验证了DHX--BE与ONOOˉ的识别机理。实验表明，DHX--BE对ONOOˉ具有比率荧光响应特性，发射峰位移达104 nm，检测限为20.4 nmol/L，且具有响应速度快、选择性高和灵敏度高等优点。因此，DHX--BE的开发对生物体内ONOOˉ的研究及其生理病理功能和疾病诊断具有潜在的应用价值。