海南黎药血叶兰的无菌播种及高效繁育技术初探

陈耀丽，尤燕平，钟云芳，吴文蝶，陈英转，杨泽秀，2

1.热带特色林木遗传与种质创新教育部重点实验室/海南大学林学院，海南海口 570228；

2.海南珠峰园林科技有限公司，海南海口 570220；

3.福建江南春城市建设集团有限公司，福建漳州363005

血叶兰（Ludisia disclor）是兰科血叶兰属草本植物，在中国主要分布福建、广东、广西、海南、云南南部、贵州等热带、亚热带地区[1]，在大洋洲的纳土纳群岛和东南亚的泰国、马来西亚、越南等地区也有少量分布[2]。血叶兰匍匐生长，喜欢阴凉湿润的环境，生长于阴凉湿润的岩石上，它的根状茎暗红色，粗壮肥厚、肉质，具有比较明显的茎节。叶片是倒卵形，暗红色或暗紫色，具有清晰的叶脉网纹，具有较高的观形观叶价值[3]。血叶兰具有味甘、性凉特性，其茎段和叶片用水煎服，可以滋阴润肺，可以治疗肺结核咳血、食欲不振[4]等症状，具有健脾安神的功效[5]，是海南传统黎药。在福建闽南地区，老百姓也推崇其药用价值[6]，已经实现量产化，应用组织培养技术生产商品血叶兰的模式不断兴起[7]。

血叶兰种子由果荚包被，一个果荚含有上千粒种子，种子只有微小的胚，不含胚乳和子叶，在自然条件下种子自身缺乏养分，难以萌发和繁殖，通过组织培养技术进行兰科植物种子无菌播种，诱导种胚萌发成苗，已经成为血叶兰保育和繁殖的重要手段。近年来，由于血叶兰的药用价值不断被挖掘出来，人为的干扰及破坏，导致血叶兰野生资源濒临灭绝，国家已将血叶兰列为二级保护植物。因此，研究野生血叶兰的无菌播种及组织快繁技术，不仅可以有效的保护野生血叶兰种质资源，也为量化生产商品血叶兰提供技术支持。

国内外对血叶兰的研究集中在开花物候及繁育[8]、内生菌共生[9]，生物学性状研究[10]，种质资源保护[11]、人工引种驯化栽培[12]、有效成分分析[13]、药用成分开发[14]，亲缘关系分析[15-16]，组织培养[17-18]等方面。该研究在此基础上，结合目前海南血叶兰生产现状，探索野生血叶兰无菌播种和组织快速繁育技术，以期为推动海南血叶兰产业化进程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

对生长在昌江霸王岭自然保护区内的野生血叶兰进行人工授粉，花粉结实后，当果荚生长成熟度达到85%，还没有开裂时，将果荚采下后，用酒精进行表面消毒保存，开展离体播种实验。

1.2 实验方法

1.2.1 种子萌发诱导

采回来的血叶兰果荚，用毛笔刷洗果荚表面后，在洗衣液中浸泡10min，然后无菌水摇晃冲洗干净后，用脱脂棉吸干表面水分，转移到消毒杀菌的超净工作台上进行播种。用75%的酒精浸泡血叶兰果荚30s 后，用无菌水清洗两遍，再用有效氯含量为0.8%的次氯酸钠溶液消毒5min～8min，期间不断摇晃瓶子，用无菌水冲洗5 遍～7 遍，风干表面水分后。将果荚放置在经高温消毒的滤纸上，切开血叶兰果荚，将种子均匀散播到到不同培养基中。该种子萌发诱导实验中，使用花宝1 号、KC、1/2MS 培养基作为基础培养基，分别添加20g/L 的土豆和100mL 的椰汁等有机物，具体的培养基配方见表1。

表1 诱导血叶兰种子萌发的添加土豆和椰汁的不同培养基Tab.1 Formulas of Ludisia discolor Seeding Medium with Potato and Coconut Juice

血叶兰种子播种后，先暗培养7d，再将播种后的种子转到25℃的培养室，培养的光强是1500lx～2000lx，每天的光照时间是12h～14h。培养60d 后，记录血叶兰种子萌动时间，统计发芽率。

1.2.2 根状茎分化诱导

血叶兰种子萌发后，产生白色絮状根毛和原球茎。将原球茎转接到添加不同花宝种类的1/2MS 培养基中，每1L 培养基中均添加蔗糖20g、添加琼脂7g/L、添加活性炭1g，调节培养基的pH 值为5.8～6.0。具体的培养基配方见表2，每个配方重复3 次，每次重复接种10 个，正常光照培养45d 后，统计血叶兰根状茎的诱导分化率。

表2 诱导血叶兰根状茎分化的添加不同花宝的培养基Tab.2 Formulas of Ludisia discolor Rhizome Induction Medium

1.2.3 血叶兰根状茎增殖培养

以1/2MS 作为基本培养基，每升培养基中添加20g/L 蔗糖、7g/L 琼脂和1g/L 活性炭，激动素（KT）设置4 种不同浓度，分裂素（NAA）设置3 种不同浓度，设置12 组不同的激素配比，KT 和NAA 的浓度组合见表3。每个激素组合的配方接种10 瓶，每瓶接种5 个血叶兰根状茎，培养60d 后统计血叶兰根状茎丛芽增殖情况。

表3 添加不同激素的诱导血叶兰根状茎丛芽增殖培养基Tab.3 Formulas of Ludisia discolor Rhizome Proliferation Medium

1.2.4 壮苗生根培养

选择已经长出3 片叶子，长势相对一致的血叶兰无菌苗，探索不同浓度的吲哚丁酸(IBA)和不同浓度的萘乙酸(NAA)组合在一起对血叶兰无菌苗长势和生根的影响。IBA 和NAA 均设置3 个不同梯度浓度，以1/2MS 作为基本培养基，在培养基中添加不同浓度的IBA 和NAA 等生长调节剂，两种激素的浓度如表4 所示。每种生根培养基转接30 株血叶兰增殖苗。经过60d 的培养，统计血叶兰生根和株高情况。

表4 血叶兰壮苗生根培养基添加的激素种类和浓度Tab.4 Additions of Ludisia discolor Strenthening Shoot and Rooting Medium

2 结果与分析

2.1 种子萌发诱导

血叶兰种子在所有处理组上都可以萌发，其种子萌发的时间和萌芽率结果有较大差异，种子萌发整齐度也不一致。血叶兰种子萌动的时间、萌芽率和萌发生长状态见表5。

表5 添加不同有机物的培养基对血叶兰种子萌发的影响Tab.5 Results of Seed Germination on Different Medium

从表5 中可以看出，在萌发时间上，血叶兰种子在添加了土豆的KC 培养基上萌动最快，时间最短，只有20d，萌动时间明显短于其他培养基。在添加椰汁的1/2MS 的培养基中萌发最慢，萌发时间最长，为88d。在血叶兰种子萌芽率方面，在KC 培养基添加土豆有机物能显著促进血叶兰种子萌发，萌芽率为88.44%，显著高于其他5 种培养基。而1/2 MS+椰汁的培养基对血叶兰种子萌发的促进作用最小，只有11.66%，显著低于其他培养基。

血叶兰种子的萌发速度在添加土豆汁和椰子汁的实验处理中的萌发速度如下：KC+土豆＞花宝1号+土豆＞花宝1 号+椰汁＞KC+椰汁＞1/2 MS+土豆＞1/2 MS+椰汁的培养基。

血叶兰在各培养基中的萌芽率是，KC+土豆＞KC+椰汁＞花宝1 号+土豆＞1/2 MS+土豆＞花宝1 号+椰汁＞1/2 MS+椰汁。

综合血叶兰种子在各培养基中的萌发速度和萌发率，优选出在诱导血叶兰种子萌发的培养基是：KC+20g/L 土豆+20g/L 蔗糖+7g/L 琼脂+1.0g/L 活性炭。

图1 血叶兰种子萌动图（A、B：种胚膨大；C、D、E：种胚变大，突破种皮，出现白色絮状根毛；F：分化出分生组织）Fig.1 Ludisia discolor Seed Germinated (A-B：Seed Embryo Swell；C-E：Continued Embryo Enlargement,Testa Ruptured，Rhizoids Present；F：Appearance of Protomeristem)

2.2 1/2MS 基础培养基添加不同型号的花宝对血叶兰根状茎分化的影响

从表6 中可以看出，添加不同花宝的1/2 MS 培养基均能诱导血叶兰根状茎分化，在不同培养基中，均能观察到血叶兰茎段表面长满白色的根毛絮状物（见图2-A）。血叶兰种子在培养基中培养10d 后，发现所有处理组的根状茎的顶端陆续分化出白色紧凑的芽点，说明所有添加花宝的处理均能使血叶兰根状茎分化发芽。实验结果表明，在诱导血叶兰根状茎分化发芽方面，添加了花宝4 号的1/2MS 培养基对血叶兰根状茎影响最大，诱导率显著高于其他添加花宝的处理组，为98.3%。在1/2MS 中添加不同花宝的培养基，对血叶兰根状茎分化的诱导率的先后顺序是，1/2MS+花宝4 号＞1/2MS+花宝1 号＞1/2MS+花宝2 号＞1/2MS+花宝5 号＞1/2MS+花宝3 号。

图2 血叶兰根状茎诱导发芽Fig.2 The Rhizome Bud Induction

表6 1/2MS 培养基添加不同花宝诱导血叶兰根状茎分化情况Tab.6 Results of Rhizome Induction on Different Medium

在生长势方面，血叶兰在添加花宝4 号的1/2MS 培养基中的长势最好，优于其他培养基，其优先顺序为：1/2MS+花宝4 号>1/2MS+花宝1 号=1/2MS+花宝2 号>1/2MS+花宝5 号=1/2MS+花宝3 号。

2.3 不同激素配比对血叶兰根状茎丛生芽增殖的影响

根据表7 可知，以1/2 MS 作为基础培养基，添加不同浓度的KT 和NAA，可以诱导血叶兰根状茎丛生芽增殖，增殖苗的状态较佳。实验结果表明，在KT 浓度分别固定在1.0mg/L 和3.0mg/L 时，当NAA的浓度从0.1mg/L 逐渐递增到0.5mg/L 时，血叶兰的根状茎丛生芽数量呈现先增多后减少的趋势。当NAA 的浓度在0.3mg/L 时，丛生芽的增殖系数达到顶峰值。当两种激素的浓度是3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA 时，血叶兰根状茎诱导的丛生芽的数量最多，生长势较佳。当KT 的浓度为5.0mg/L 时，随着NAA 浓度的增加，血叶兰丛生芽增殖系数减少，但茎段之间的增殖倍数差异不显著。

表7 血叶兰丛生芽不同激素种类和浓度的培养基诱导增殖情况Tab.7 Results of 1/2MS with Different Hormones to induce Ludisia Discolor Multipropagation

当NAA 浓度是0.1mg/L 和0.5mg/L 时，血叶兰的丛芽数量随着KT 浓度的增加而增加，但差异并不显著。当NAA 是0.3mg/L 时，随着KT 浓度的增加，血叶兰的根状茎丛芽增殖系数先增加，然后减少，且显著较差异，说明KT 的浓度对血叶兰根状茎丛生芽增殖诱导影响比较大。

图3 血叶兰根状茎丛生芽诱导增殖Fig.3 The Rhizome Bud Micropropagation

2.4 不同激素的培养基对血叶兰壮苗生根的影响

将有3 片真叶的血叶兰无菌苗接种在同时添加不同浓度的IBA 和NAA 的1/2MS 基础培养基中，培养20d 后，血叶兰无菌苗根状茎基部开始萌动突起，出现乳白色的根毛，且逐渐长出新叶。培养45d 左右，血叶兰叶片展开长大，根茎粗壮，根毛茂盛，60d后统计生根数量。

图4 血叶兰无菌苗壮苗生根Fig.4 Shoots Strengthening and Roots Induction of Ludisai Discolor

从表8 中可以看出，IBA 和NAA 组合在一起时，能够促进血叶兰壮苗和生根。当NAA 浓度一定时，将IBA 浓度由0.1 mg/L 增加到0.5 mg/L 时，血叶兰的株高随着IBA 浓度的增加而明显升高，当IBA 浓度由0.5 mg/L 增加到1.0 mg/L 时，血叶兰的株高随着IBA 浓度的增加而逐渐减少，说明当IBA 的浓度小于等于0.5 mg/L，IBA 能促进血叶兰的生长，而IBA 浓度≥0.5 mg/L，血叶兰的生长状态随着IBA浓度的增加而减弱，说明高浓度的IBA 和低浓度的NAA 混合配比时，能使血叶兰的生长和生根得到抑制。因此，血叶兰最适的生长和生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+5%香蕉+20g/L蔗糖+7g/L 琼脂。

表8 1/2MS 培养基添加不同浓度的IBA 和NAA 对血叶兰壮苗生根的影响Tab.8 Resules of Different Medium inducting Ludisia discolor Rooting

3 讨论

有很多种培养基可以诱导血叶兰种子离体萌发，如VW、KC、花宝系列、1/2MS 和MS 培养基等。该研究中比较了添加土豆和椰汁的KC、1/2MS、花宝1号等三种不同的培养基对血叶兰种子萌发的影响。研究表明，血叶兰在添加了土豆KC 培养基上萌发最快，添加土豆的花宝1 号次之，添加土豆的1/2MS培养基萌发最慢。而李宏杨[18]的研究结果显示，血叶兰种子在1/2MS 和花宝1 号萌发时间差不多。出现差异的原因有可能是，在该研究中，笔者在1/2MS 和花宝1 号培养基中添加了土豆和椰汁等有机物质，有机物与基本培养基的相互作用影响了种子养分的吸收[19]。另外，血叶兰种子的萌发也会受到种子来源、种子活力、培养温度、光照、湿度等条件的影响。在开展研究工作时，需要尝试几种不同的培养基，才能选择出合适的诱导血叶兰种子萌发的培养基。廖红英、刘雅舒、高壮壮等通过在培养基中添加花宝1号和花宝2 号，成功诱导德氏兜兰的原球茎和蝴蝶兰不定芽增殖分化[20-21]，诱导墨兰根状茎的分化及生长[22]，这与该研究中不同的花宝种类成功诱导血叶兰根状茎分化的结果一致，而在研究中，以花宝4号对血叶兰根状茎分化诱导率最高，且长势最好，这可能与花宝4 号的N、P、K 比例有关，较适宜促进根状茎新芽和根的分化有关。

血叶兰在不同的根状茎分化、丛芽增殖培养等生长阶段需要不同的种类和不同浓度的激素。苏建睦[20]在研究6BA，NAA，TDZ 等三种激素对血叶兰丛芽增殖的研究中发现，在MS 培养基中添加高浓度的6-BA 和低浓度的NAA、TDZ 时，可以促进血叶兰根状茎丛芽增殖，增殖系数达到4.92。朱桥的研究结果发现[23]，最适宜血叶兰根状茎丛生芽增殖的培养基为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+15%香蕉汁，丛芽增殖系数达到4.83。在该研究中，筛选出最适宜诱导血叶兰根状茎丛芽生长的培养基是1/2MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA+20g/L 蔗糖+1g/L 活性炭+7g/L 琼脂，丛芽长势较好，增殖系数达到5.05。这与王高鹏使用1.5mg/L KT+0.5mg/L NAA 诱导白芨增殖的方法相似[24]。

植物生长调节剂IBA、NAA 对壮苗生根起到重要作用，苏建睦的研究结果表明，最适宜血叶兰壮苗生根的培养基是0.5mg/L NAA+1.6mg/IBA+15%香蕉，生根率达到93.0%[17]。在血叶兰壮苗生根实验中，使用适宜浓度的IBA 和NAA，同时配合使用有机添加物香蕉，植株生长旺盛，可以大幅提高生根率，生根效果好。该研究表明，在血叶兰无菌苗壮苗生根时，使用1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+50g/L 香蕉+20g/L 蔗糖+7g/L 琼脂的配方，能够显著促进血叶兰生长、生根和苗的质量，生根率达到100%。