红海榄幼苗生长对海平面上升的适应性研究

吕晓波，钟才荣，张孟文，方赞山，程成

海南省林业科学研究院（海南省红树林研究院），海南海口571100

红树林是分布于热带与亚热带海岸潮间带滩涂的木本植物群落[1]，在防风消浪、保滩护堤、净化海水等方面具有重要作用。但由于长期不合理的开发利用以及全球气候变化造成的海平面上涨，天然红树林已大面积的消失和退化，红树林面临着资源枯竭的严重处境。为了更好地保护和恢复红树林资源，红树林研究工作亟待更全面、更深入的发展。目前，大量研究认为，水体盐度及淹水时间是影响红树林恢复的主要影响因子[2-3]。开展红树林植物对水体盐度和淹水胁迫的适应性研究，将为红树林恢复提供理论和实践依据。关于淹水胁迫和盐胁迫对红树植物幼苗的影响，前人已做了大量的研究，但大部分都基于单因素胁迫的研究[4-8]，而对于淹水和盐双胁迫的研究少有报道，已报道的研究多关注于双因素胁迫下幼苗的生长变化规律[3，9-10]。自然环境中，淹水胁迫和盐胁迫同时作用于红树林植物，双胁迫下红树林植物幼苗表现出的耐盐性与耐淹性可能与单因素胁迫有所差异。因此，该次针对水体盐度和淹水时间双胁迫对红树植物红海榄幼苗的抗逆性的影响开展研究，以探讨红树植物幼苗对海平面上升造成的水盐环境变化的生理适应策略，为红树林恢复和保护提供一定的理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

红海榄的幼苗来自东寨港国家级红树林自然保护区苗圃，为发育良好、生长基本一致的健康植株，进行该次的盐度-淹水双因素的胁迫研究。

1.2 方法

1.2.1 实验体系设置

建立10‰、20‰、30‰、40‰四个盐度梯度以及4h、8h、12h、16h 四个淹水时间的交叉实验体系，共计16 组处理。每组3 株幼苗，重复3 次，共计144 株。盐度处理使用海盐和自来水配置，每周检查盐度水平并及时调整盐度水平。淹水处理使用水泵定时注/排水进行淹水时间的控制。实验结束后，采集植株上无损伤的成熟叶片进行各项生理指标的测定。

1.2.2 生理指标测量

生理指标的测定方法参考相关文献[11-12]。采用氮蓝四唑（NBT）比色法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性；采用硫代巴比妥酸法测定叶片丙二醛（MDA）的含量；采用茚三酮法测定叶片游离脯氨酸（PRO）的含量。

1.3 数据统计与分析

数据采用Spss20 和Excel2010 软件进行数据的统计分析，其中方差分析采用双因素方差分析，多重比较使用最小显著差异法（LSD）。

2 结果与分析

2.1 盐度-淹水时间胁迫对红海榄幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由表1 可知，盐度-淹水双胁迫对红海榄幼苗叶片内的SOD 活性影响，具有极显著的交互作用（p＜0.01），淹水胁迫对叶片内的SOD 活性影响，各处理间差异极显著（p＜0.01）。叶片内SOD 活性随着淹水胁迫的增强，SOD 活性呈现先降后升再降的趋势4h＞12＞8h＞16h。然而盐度胁迫中30‰和20‰两者之间差异不显著（p＞0.05），除此之外各处理间差异极显著（p＜0.01）。随着盐度胁迫的增强，SOD活性呈现先升后降的趋势20‰＞30‰＞10‰＞40‰。

从图1 和表1 可以看出，幼苗叶片内SOD 的极值都出现在40‰盐度组，分别是盐度40‰-淹水4h，叶片内SOD 活性最高，为179.29±0.57U·g-1，盐度40‰-淹水16h，叶片内SOD 活性最低，为143.32±0.73U·g-1，其他处理介于两者之间。在盐度10‰处理组，叶片内SOD 活性随淹水胁迫的加深呈现先升后降的趋势，经多重比较分析（表1），各淹水处理间差异极显著(p＜0.01)；盐度20‰处理组，随着淹水胁迫的增加，叶片内SOD 活性呈现先降后升的趋势，各淹水处理间差异极显著(p＜0.01)；盐度30‰处理组，随淹水胁迫的增强，叶片内SOD 活性呈现先降后升再降的趋势，其中8h 和16h 差异不显著（p＞0.05），其他处理差异极显著(p＜0.01)；盐度40‰处理组，随淹水胁迫的加深，叶片内的SOD 活性呈现逐渐降低的趋势，各淹水处理间差异极显著(p＜0.01)。淹水4h 随着盐度胁迫的增强，叶片内SOD 活性逐渐升高，多重比较分析10‰和20‰差异不显著（p＞0.05），除此之外各处理间差异极显著(p＜0.01)；淹水8h，随盐度胁迫的加深，叶片内的SOD 活性先降后升，其中10‰和40‰差异不显著（p＞0.05），20‰和30‰差异也不显著（p＞0.05）；淹水12h，随盐度的升高叶片内的SOD 活性先降后升再降的趋势，各淹水处理间差异极显著(p＜0.01)；淹水16h，叶片内SOD 活性随盐度增加先升后降,各处理间差异极显著(p＜0.01)。

表1 水盐胁迫下红海榄幼苗叶片内SOD 活性差异性分析Tab.1 Analysis of the Activity Difference of SOD in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

图1 水盐胁迫对红海榄幼苗叶片内SOD 活性的影响Fig.1 Effect of Water Salt Stress on SOD Activity in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

综上所述，在水盐双胁迫下，水体盐度和淹水时间共同影响叶片内的SOD 活性，随着盐度胁迫或淹水胁迫的增强叶片内的SOD 活性大体上呈现出先增后降的趋势，这说明植物可以通过增强SOD 活性在一定程度上缓解胁迫造成的损伤，但同时也表明SOD 的保护作用是有一定耐受范围，当胁迫伤害超出其耐受范围，随着胁迫的继续增强其活性有所降低。盐度超过30‰、淹水超过12h 叶片内的SOD 活性都出现下降的趋势。

由表2 可知，盐度-淹水胁迫对红海榄幼苗叶片内POD 活性影响具有极显著的交互作用（p＜0.01）。淹水胁迫对叶片内POD 活性的影响极显著（p＜0.01），叶片内POD 活性在淹水胁迫的增加情况下，呈现逐渐降低的趋势4h＞8h＞12h＞16h。而盐度胁迫20‰与10‰差异不显著（p＞0.05），40‰与20‰差异显著（p＜0.05），其他各处理间差异极显著（p＜0.01），随盐度胁迫的增强，呈现先升后降的趋势30‰＞40‰＞20‰＞10‰。

结合表2 和图2 可知，叶片内POD 活性的极值都出现在30‰的盐度处理组，盐度30‰-淹水4h 叶片内POD 活性最强，达到25844.90±255.17U·g-1·min-1显著高于其他处理（p＜0.01），盐度30‰-淹水16h 叶片内POD 活性最弱，为4881.48±70.62U·g-1·min-1显著低于其他处理（p＜0.01）。随着淹水胁迫的逐渐增强，盐度10‰组叶片内POD 活性呈现先降后稳定的趋势，淹水4h 与其他处理差异极显著（p＜0.01），8h、12h 和16h 淹水处理间差异不显著（p＞0.05）；盐度20‰组叶片内POD 活性呈现先升后降在稳定的趋势，淹水12h 和16h 差异不显著（p＞0.05），其他各处理间差异极显著（p＜0.01）；盐度30‰组叶片内POD 活性呈现逐渐降低的趋势，各淹水处理间差异极显著（p＜0.01）；盐度40‰叶片内的POD 活性呈现先升后降再稳定的趋势，淹水8h 与其他组差异极显著（p＜0.01），淹水4h、12h 和16h 差异不显著（p＞0.05）。随着盐度胁迫的增强，淹水4h叶片内POD 活性呈现先升后降的趋势，10‰和20‰差异不显著（p＞0.05），其他各处理差异极显著（p＜0.01）；淹水8h 叶片内的POD 活性呈现先升后降再升的趋势，各处理间差异极显著（p＜0.01）。淹水12h叶片内POD 活性呈现先降后升的趋势，20‰和30‰两者差异不显著（p＞0.05），其他处理差异极显著（p＜0.01）。淹水16h 叶片内的POD 活性呈现先降后升的趋势，各处理间差异极显著（p＜0.01）。

表2 水盐胁迫下红海榄幼苗叶片内POD 活性差异性分析Tab.2 Analysis of the Activity Difference of POD in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

图2 水盐胁迫对红海榄幼苗叶片内POD 活性的影响Fig.2 Effect of Water Salt Stress on POD Activity in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

由上可知，水盐双胁迫下，盐度和淹水时间对叶片内的POD 活性都有影响，两者影响下，POD 活性变化趋势有所不同，盐度胁迫下POD 活性先升后降，淹水胁迫下POD 活性逐渐降低，盐度超过30‰、淹水超过4h 叶片内的POD 活性都呈下降的趋势，可以看出POD 对淹水胁迫更敏感。

过氧化氢酶（CAT）活性由表3 可知，盐度-淹水胁迫对红海榄幼苗叶片内的CAT 活性影响的交互作用极显著（p＜0.01），淹水胁迫对叶片内CAT 活性影响极显著（p＜0.01），盐度胁迫各处理间差异显著（p＜0.05）。随着淹水胁迫的增强，叶片内的CAT 活性呈现先升后降的趋势8h＞12h＞16h＞4h。随着盐度的增强，呈现先升后降的趋势30‰＞20‰＞10‰＞40‰。

表3 水盐胁迫下红海榄幼苗叶片内CAT 活性差异性分析Tab.3 Analysis of the Activity Difference of CAT in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

从图3 可以看出，叶片内CAT 活性的最强的是盐度30‰-淹水12h 的处理9481.03±272.05U·g-1·min-1，与其他处理差异极显著（p＜0.01），而活性最小的是盐度10‰-淹水4h 的处理1667.53±251.84U·g-1·min-1，和盐度30‰-淹水4h 的处理1780.70±105.44U·g-1·min-1两者差异不显著（p＞0.05）。随着淹水胁迫逐渐增强,叶片内的CAT 活性在盐度10‰、20‰、30‰及40‰处理下呈现先增强后降低的趋势，而略有不同的是盐度10‰、20‰及30‰三组处理的活性峰值的都出现在淹水8h 的处理组，盐度40‰处理，活性峰值在淹水12h 处理组。盐度10‰、20‰、30‰及40‰各组内的处理都差异极显著（p＜0.01）。随盐度胁迫增强，幼苗叶片内CAT 活性在淹水4h 处理组呈现先升后降再升，经多重比较分析10‰和30‰两者差异不显著（p＞0.05），其他各处理差异极显著（p＜0.01）。淹水8h处理组，叶片内CAT 活性呈现先降后升的趋势，10‰和20‰两者差异不显著（p＞0.05），其它各处理差异极显著（p＜0.01）。盐度12h 和16h 处理组两者叶片内的CAT 活性都呈现先升后降的趋势，两者组内各盐度处理差异极显著（p＜0.01）。

图3 水盐胁迫对红海榄幼苗叶片内CAT 活性的影响Fig.3 Effect of Water Salt Stress on CAT Activity in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

由上可知，水盐双胁迫下叶片内CAT 活性都受到盐度和淹水时间的影响，随着盐度的增加呈现先升后降的趋势，随着淹水时间的增加，也呈现先升后降的趋势，盐度超过30‰、淹水时间超过8h 叶片内的CAT 活性都呈下降的趋势。说明盐度30‰以下或淹水8h 以下，幼苗的CAT 活性都在耐受范围以内。

2.2 盐度-淹水胁迫对幼苗叶片膜脂过氧化的影响

由表4 可知，盐度-淹水胁迫对幼苗叶片内的MDA 的含量影响具有极显著的交互作用（p＜0.01）,盐度胁迫对叶片内MDA 的影响极显著（p＜0.01）。而淹水胁迫12h 和16h 差异不显著（p＞0.05），16h 与4h 差异显著（p＜0.05），其它处理间差异极显著（p＜0.01）。随着盐度胁迫的增加，MDA 含量呈现先升后降再升的趋势，20‰＞40‰＞30‰＞10‰。随着淹水胁迫的增强，呈现先升后降的趋势8h＞12h＞16h＞4h。

表4 水盐胁迫下红海榄幼苗叶片内MDA 含量差异性分析Tab.4 Analysis of the Content Difference of MDA in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

如图4 所示，叶片内的MDA 含量的极值都出现在淹水4h 的处理组，盐度30‰-淹水4h 处理，叶片内的MDA 含量最高51.71±0.42μmol·g-1，膜质损伤最严重，盐度40‰-淹水4h 处理叶片内MDA 含量最低24.64±0.34μmol·g-1，膜质损伤最轻。随着淹水胁迫的增加，叶片内MDA 含量在盐度10‰处理下呈现先升后降的趋势，经多重比较分析，各淹水处理间差异极显著（p＜0.01）；在盐度20‰叶片内MDA含量呈现先降后升的趋势，淹水8h 与其他处理差异极显著（p＜0.01），4h、12h 和16h 三者差异不显著（p＞0.05）；在盐度30‰处理叶片内的MDA 含量呈现先降后升的趋势，各处理间差异极显著（p＜0.01）；在盐度40‰处理叶片内MDA 含量呈现先升后降再升的趋势，各淹水处理间差异极显著（p＜0.01）。随着盐度胁迫的增强，叶片内MDA 含量在淹水4h 处理组呈现先升后降的趋势，各处理间差异极显著（p＜0.01）；在淹水8h 处理组叶片内MDA 含量呈现先降后升的趋势，10‰和20‰两者差异不显著（p＞0.05），其他处理间差异极显著（p＜0.01）；在淹水12h 和16h 处理组，随着盐度胁迫的增强，两组叶片内的MDA 含量都呈现先升后降再升的趋势,两组内各处理间差异极显著（p＜0.01）。

综上所述，水盐胁迫对幼苗叶片都有所损伤，叶片内MDA 含量的变化随着盐度的增加，呈现先升后降再升的趋势；随着淹水时间的增加，呈现先升后降的趋势。盐度20‰叶片内MDA 含量最高，淹水8h 叶片内的MDA 含量最高，这说明胁迫初期叶片内的活性氧还在耐受范围内，随着胁迫的增强，活性氧积累过多对膜脂造成损伤，抗氧化酶体系启动分解过多的活性氧，进而降低损伤，MDA 含量降低。而当抗氧化酶活性达到一定限度，MDA 含量会上升。

2.3 盐度-淹水胁迫对幼苗叶片内渗透调节物质脯氨酸（Pro）的影响

表5 所示，盐度-淹水胁迫，盐度和淹水对叶片内Pro 含量变化有极显著的交互作用（p＜0.01），盐度对叶片内Pro 含量影响也是极显著的（p＜0.01），而淹水胁迫16h 与其他淹水处理差异极显著（p＜0.01），4h、8h 及12h 三者之间差异不显著（p＞0.05）。随着盐度胁迫的增强红海榄幼苗叶片内Pro含量呈现先升后降的趋势20‰＞10‰＞30‰＞40‰。随着淹水胁迫的增强，叶片内Pro 含量也呈现下降的趋势8h≥4h≥12h>16h。

表5 水盐胁迫下红海榄幼苗叶片内Pro 含量差异性分析Tab.5 Analysis of the Content Difference of Pro in the Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

叶片内Pro 含量极值都出现在淹水4h 处理组，盐度20‰淹水4h 处理叶片内Pro 含量最高1284.66±15.80μg·g-1，盐度40‰-淹水4h 处理叶片内Pro 含量最低610.52±19.58μg·g-1,两者与其他处理都差异极显著。随着淹水胁迫的增加，叶片内Pro 含量在盐度10‰处理组呈现先升后降的趋势，经多重比较分析各处理间差异极显著（p＜0.01）；在盐度20‰处理组，呈现逐渐降低的趋势，淹水12h和16h 两者间差异不显著（p＞0.05），其他各处理间差异极显著（p＜0.01）；在盐度30‰处理组呈现先降后升的趋势，淹水12h 和16h 两者差异不显著（p＞0.05），其他处理间差异极显著（p＜0.01）；在盐度40‰处理组，叶片内Pro 含量呈现先升后降再升的趋势，各处理间差异极显著（p＜0.01）。随着盐度的增加，叶片内Pro 含量在淹水4h 处理组呈现先升后降的趋势，各处理间差异极显著（p＜0.01）；在淹水8h 和16h 处理组，叶片内Pro 含量都是呈现先升后降再升的趋势，组内各处理间差异极显著（p＜0.01）；在淹水12h 处理组呈现逐渐降低的趋势，各淹水处理差异极显著（p＜0.01）。

综上所述，水盐胁迫对叶片内Pro 含量影响，盐度胁迫要强于淹水胁迫造成的影响。随着盐度的增加，Pro 含量呈现先升后降的趋势，盐度20‰叶片内Pro 含量最高。超过20‰，Pro 含量呈现降低的趋势。这说明Pro 对盐度胁迫的缓解具有一定作用。随着淹水时间的增加Pro 含量呈现下降的趋势，淹水16h，叶片内的Pro 含量最低。

图5 水盐胁迫对红海榄幼苗叶片内Pro 含量的影响Fig.5 Effect of Water Salt Stress on Pro Content in The Leaves of Rhizophora stylosa Seedlings

3 结论与讨论

3.1 盐度-淹水胁迫下幼苗抗氧化酶活性响应

正常状态下，植物细胞内活性氧自由基产生和清楚处于平衡状态，当植物收到胁迫时，平衡打破，活性氧自由基会在细胞内积累，而SOD 是抵御活性氧伤害的“第一道防线”[13]，SOD 清除植物细胞内的超氧自由基，同时产生歧化产物H2O2，避免超氧自由基对膜损伤[14]，生成的H2O2则是被POD、CAT 分解成水和分子氧[15-16]，因此植物抗逆性的大小常与抗氧化酶活性息息相关。植物对逆境的应激反应一般表现为提高抗氧化酶活性以消除自由基的积累，保护膜结构[17-18]。但是当胁迫超出其耐受范围，胁迫程度越高，酶活性有所降低[19-20]。该研究结果表明，红海榄幼苗叶片内SOD、POD 和CAT 活性，对水盐胁迫都有一定的缓解作用，从三者的变化趋势来看，盐度胁迫下三者的趋势较同步都是超过30‰后活性降低，说明三者对盐度胁迫的响应较为一致。而从淹水胁迫来看，略有不同，SOD 活性12h 后降低、CAT 活性8h 后降低、POD 活性4h 后降低，由此可以说明SOD对淹水胁迫的耐受性范围较大，CAT 次之，POD 最小。蓝巧武等[25]研究表明，单一的盐胁迫下，随盐度的升高，红海榄幼苗叶片内SOD 活性呈先升后降再回升的趋势，POD 活性呈现先升后降的趋势。与该研究的盐度胁迫下SOD 先升后降的结果基本一致，差异之处可能是由于淹水胁迫影响造成,POD 活性的变化趋势。郑海雷等[26]研究发现海莲叶片SOD 活性在中等盐度下随盐度增加而升高，高盐度时迅速下降；木榄叶片内的SOD 活性在低盐度下迅速升高，中高盐度时维持较高的SOD 水平。与该研究的结果既相似又有差异，这说明不同物种间SOD 活性的耐受性范围不同，进而会影响不同红树植物的盐度上的分布。Ye 等[27]研究表明长时间的淹水促进秋茄叶片的SOD和POD 活性显著增高。Chen 等[28]研究发现淹水时间超过8h 幼苗叶片的SOD 和POD 活性显著提高。与该研究的结果有相似又存在差异，相似的是随淹水胁迫增加抗氧化酶活性都有增强的趋势，但当胁迫达到一定程度，超过了抗氧化酶耐受性范围，其活性就开始降低。这说明不同物种间SOD 和POD 活性都可以缓解淹水胁迫的损伤，但物种间淹水胁迫的耐受性存在差异，也反映了不同物种的淹水胁迫抗性存在差异，进而影响着物种在淹水区域上的分布。

3.2 盐度-淹水胁迫下幼苗的膜脂过氧化影响

丙二醛MDA 是植物逆境和衰老过程中膜质过氧化的重要产物，其产生和积累会导致膜脂过氧化加剧，从而破坏植物膜脂。MDA 含量在一定程度上反映植物受逆境伤害程度[14，20-21]。该研究表明，盐度增加MDA 含量王文卿等研究发现单一的盐胁迫下，随盐度的升高，秋茄叶片内的SOD 活性先升后降MDA 含量下降。该研究发现，随着盐度的升高，叶片内的MDA 先升后降再升的趋势，与叶片内的SOD、POD 和CAT 活性变化趋势类似也是先升后降，但峰值滞后于MDA。这说明MDA 升高膜质受到损伤，抗氧化酶可以在一定范围内缓解胁迫造成的膜质损伤，进而增强活性，MDA 含量降低，抗氧化酶活性变化要滞后于MDA 含量的变化，且超过耐受范围后，酶活性减弱，MDA 含量会有所上升。

3.3 盐度-淹水胁迫下幼苗叶片渗透调节物的相应

植物细胞的渗透调节作用是植物适应环境，增强抗逆性的基础，也是植物对盐分和水分胁迫的重要手段之一[22]。游离脯氨酸含量的增加是植物适应逆境胁迫的一种生理生化反应[23]，多数植物在逆境中积累游离脯氨酸[20]，该研究中Pro 含量随盐度的增加呈现先升后降的趋势，这是植物对胁迫的一种生理适应，说明盐度胁迫增强，超出其耐受性范围，细胞结构和功能受到损伤，渗透调节能力降低，该结论与谭芳林等[9]研究水盐胁迫下秋茄幼苗的生理适应的结果一致。廖宝文等[8]研究表明，单一的淹水胁迫下，秋茄Pro 含量随淹水时间的延长，呈现先降后升的变化趋势。该研究中，随着淹水时间的延长，Pro含量呈逐渐下降的趋势，这可能是由于不同物种间Pro 的含量变化有所差异，也有可能是由于盐度和淹水的交互作用的影响。