蜜蜂生殖细胞的超低温冷冻方法

庄明亮 李剑飞 李志勇 王志 葛蓬│文

吉林省养蜂科学研究所，吉林 132108

蜜蜂是重要的社会性昆虫，占授粉昆虫总数的80%，具有巨大的生态和经济价值，且是实现农业绿色发展的重要一环。我国拥有丰富的蜜蜂遗传资源，然而，在过去十年里全球范围内蜜蜂种群受到巨大威胁，包括来自自然环境、农药、寄生虫等因素[1]，蜜蜂珍惜种质资源的保护和开发利用显得尤为重要。超低温冷冻蜜蜂生殖细胞技术不受地域、时间和蜂王寿命的限制，为蜜蜂种质资源的保护开辟了新途径。

利用低温冷冻技术保存生物资源由来已久，1776年，Sallanzani 利用雪冷冻马的精子即是这方面最早的记载，1951年Stewart 用冷冻精液授精成功生下一头牛犊[2]，这是世界第一例使用冷冻的精液授精并成功的案例，1964年Sawada 等首先利用甘油作为冷冻保护剂能够将蜜蜂精液冷冻保存成功[3]。蜜蜂生殖细胞低温冷冻保存技术发展到今天，根据冷冻过程中降温速率不同可分为2 种：第一种是逐步降温冷冻法（程序化冷冻法），第二种是玻璃化冷冻法。

一、冷冻机理

逐步降温法采用分步降温，先将保存材料慢速降温至置核温度，再放入液氮中保存。该法适用于单细胞、少细胞或含单一细胞类型的生物材料，蜜蜂精液的冷冻保存多采用逐步降温法。精液冷冻温度降低过程，精子膜的完整性受到冰晶的破坏，导致细胞内酶、脂类、各种离子释放从而对精子造成损伤，这个时期的控制好低温速率和投入液氮时精液温度才能减小冰晶化对精子的损伤[4]。

玻璃化冷冻保存是指以非常快的速率将保存材料降温至液氮及液氮温度以下时，出现非晶态的现象，这种非晶态被称为玻璃态[5]。玻璃化冷冻方法是通过使用高浓度的冷冻保护剂使细胞脱水，0℃以上直接投入液氮中，使冷冻材料快速冷却（15,000 ～30,000℃/min），液体粘度增加，当达到临界值时发生凝固化，避免了细胞内冰晶的形成。该法适用于些多细胞类型的复杂生物材料，蜜蜂的胚胎多采用玻璃化冷冻法。

二、冷冻降温方法

1.冷冻前的渗透化处理

蜜蜂的胚胎外层有保护结构，保护剂无法渗入，所以采用玻璃化冷冻方法冷冻蜜蜂胚胎时必须要有去除保护结构的渗透化处理，而冷冻蜜蜂精液则无需渗透化处理。对渗透起主要障碍的是蜜蜂的外卵壳和蜡质层，外卵壳是有多种蛋白组成的网格状结构，蜡质层主要由脂类物质构成。

目前渗透化处理的方法有机械去除法[6]、酶消化法[7]、次氯酸钠和链烷烃类并用法[8]。机械去除法者需很高的操作技巧，且易对胚胎造成致死性机械损伤，酶消除法处理时间较长且成本较高。蜜蜂胚胎的渗透化处理采用次氯酸钠和链烷烃类并用法，用2%～5%的次氯酸钠去除蜜蜂胚胎的外卵壳，再用庚烷或正己烷去除蜡质。

2.加入冷冻保护剂

根据冷冻保护剂能否进入细胞内部分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。渗透性保护剂能够进入细胞内部，当细胞外溶液出现冰晶时，进入细胞内部使细胞内溶液浓度升高，细胞内外渗透压平衡，避免细胞过分脱水而皱缩同时减少细胞外高浓度电解质的损伤。这类冷冻保护剂主要包括甘油、二甲基亚砜、酰胺类等。非渗透性保护剂难以进入细胞内部，但可以结合细胞外水分子，使细胞外自由水含量降低，减少细胞内外的冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤的保护剂主要包括：卵黄、低密度脂蛋白等。

蜜蜂采用逐步降温法冷冻精子是可以采用甘油、二甲亚砜、卵黄等渗透性保护剂和非渗透性保护剂[9,10]，采用玻璃化冷冻胚胎时多采用乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜等渗透性保护剂[11,12]。

3.冷冻降温步骤

低温冷冻蜜蜂精子是采用逐步降温法，降温程序很关键。首先混合冷冻保护剂的精液在4℃环境中平衡数小时，根据本团队研究结果，采用2 ～5℃/min速率下降从4℃降到40℃，最后把混合冷冻保护剂的精液直接投入到液氮中。

低温冷冻蜜蜂胚胎是采用玻璃化冷冻法，有一步法和两步法。一步降温法即将用冷冻保护剂处理好的蜜蜂胚胎直接投入液氮中；两步法即先在液氮蒸汽中停留几秒至几分钟，再投入液氮中保存。

三、小结

低温冷冻保存技术对于科学研究和实际应用的意义重大。它可以节约大量的人力、物力和财力，实现大批量生物活性材料的保存。逐步降温法冷冻是精子冷冻的首先方法，冷冻玻璃化冷冻是胚胎冷冻的首选方法。目前针对蜜蜂精液的逐步降温冷冻法研究较多，技术相对成熟，针对玻璃化冷冻蜜蜂胚胎研究较少，存在冷冻后胚胎孵化率低等问题，总体来说蜜蜂生殖细胞冷冻保存技术发展迄今几十年，还有很多难关需要攻克[13,14]，蜜蜂生殖细胞低温冷冻保存还有很长的路要走。