青皮的高效液相特征图谱和5个黄酮类成分含量测定

肖小春，何小芳，张英，吴孟华，曹晖，马志国*（. 无限极（中国）有限公司研发中心，广州 5040；2. 广东医科大学附属医院，广东 湛江 52400；3. 暨南大学岭南传统中药研究中心，广州 5400；4. 广东省中医药信息化重点实验室，广州 5400）

青皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮；5～6月收集自落的幼果，晒干，习称“个青皮”；7～8月采收未成熟的果实，在果皮上纵剖成四瓣至基部，除尽瓤瓣，晒干，习称“四花青皮”。青皮具有疏肝破气，消积化滞的功效；用于胸胁胀痛，疝气疼痛，乳癖，乳痈，食积气滞，脘腹胀痛[1]。青皮中含有挥发油、黄酮类、氨基酸、胺类、生物碱、有机酸等成分[2]，其中以橙皮苷、橘皮素、川陈皮素等为代表的黄酮类成分是青皮的主要药效物质基础[3-4]。2020年版《中国药典》一部中青皮以橙皮苷为含量测定指标[1]，有研究采用UPLC、HPLC对青皮中的橙皮苷、柚皮素、橘皮素、川陈皮素等成分进行定量分析[5-9]。关于青皮的HPLC特征图谱也有文献报道，但分析时间过长，且各峰分离度仍需改善[10-12]。目前尚未见到同时测定芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素5个黄酮类成分的方法报道。本研究采用HPLC建立青皮的特征图谱，并同时测定其中5个黄酮类成分的含量，以期为青皮的质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo UlitMate 3000型高效液相色谱仪，DAD检测器，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱（美国赛默飞公司）；XSR105/A十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多）；FA 2204B 万分之一电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-98-Ⅱ单列两孔恒温水浴锅（TAISITE仪器有限公司）；YF-高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精其仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品芸香柚皮苷（批号：X-080-181219）、橙皮苷（批号：Y-071-180917）、香蜂草苷（批号：X-010-171216）、川陈皮素（批号：Y-006-171216）、橘皮素（批号：G-019-171216）（成都瑞芬思生物科技有限公司，含量均大于98.0%）。乙腈（上海麦克林生化科技有限公司）、甲酸（天津科密欧化学试剂有限公司）均为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为市售分析纯。

共收集24批四花青皮药材，经暨南大学岭南传统中药研究中心马志国教授鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培变种的未成熟果实的果皮。样品信息见表1。

表1 四花青皮样品信息Tab 1 Sample information of Sihuaqingpi

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取芸香柚皮苷对照品2.24 mg、香蜂草苷对照品1.68 mg分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液A、B；分别精密称取川陈皮素对照品1.81 mg、橘皮素对照品1.29 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液C；精密称取橙皮苷对照品5.74 mg置20 mL量瓶中，精密加入对照品溶液A 4 mL、B 2 mL、C 2 mL，超声使溶解，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成含芸香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素、橙皮苷5个对照品成分质量浓度分别为44.80、16.80、7.24、5.16、287.00 μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取干燥样品粉末0.2 g（过80目筛），精密称定，置150 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理（功率700 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2 色谱条件

采用Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，15%A；10～15 min，15%～20%A；15～20 min，20%～25%A；20～30 min，25%～40%A）；流速1.0 mL·min-1，特征图谱检测波长为295 nm，含量测定检测波长为283 nm和330 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

2.3 特征图谱研究

2.3.1 精密度考察 取同一供试品溶液（SHQP-01），连续测定6次，记录色谱图。以川陈皮素（4号峰）为参照峰，计算得各色谱峰的相对保留时间的RSD均＜0.12%，相对峰面积RSD均＜3.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性考察 取同一供试品溶液（SHQP-01），分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样，分别记录色谱图。以川陈皮素（4号峰）为参照峰，计算得各色谱峰的相对保留时间的RSD均＜0.14%，相对峰面积RSD均＜3.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性考察 取同一批四花青皮（SHQP-01）样品粉末（过80目筛），按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录色谱图。以川陈皮素（4号峰）为参照峰，计算得各色谱峰的相对保留时间RSD均＜0.11%，相对峰面积RSD均＜3.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 四花青皮特征图谱的建立 取24批样品粉末，按“2.1.2”项下方法制备，进样检测，获得特征图谱，以4号峰为参照，共确定了5个特征峰，导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012 版）”（见图1），采用平均值法生成对照特征图谱（见图2），计算得到24批样品与对照特征图谱的相似度均大于0.95，表明各批次样品之间化学成分基本一致。

图1 24批四花青皮药材样品HPLC色谱图谱叠加图Fig 1 HPLC chromatogram of 24 batches of Sihuaqingpi

图2 四花青皮HPLC特征图谱共有模式图Fig 2 HPLC specific chromatogram of Sihuaqingpi

根据表2中24批四花青皮药材样品的特征图谱测定结果，峰1～5的相对保留时间范围均符合小于平均值±5%的限度要求，且RSD均＜1.00%，故以峰1～5作为青皮药材的特征峰。以4号峰为参照峰，分别计算各特征峰的相对保留时间，结果各特征峰的相对保留时间值分别为峰 1（0.410）、峰 2（0.437）、峰 3（0.554）、峰 4（1.000）、峰 5（1.202），其相对保留时间应在制订值的±5%之内，积分参数斜率灵敏度为10，峰宽为0.1，最小峰面积为2。

表2 24批四花青皮药材样品特征图谱中5个特征峰相对保留时间Tab 2 Relative retention time of 5 peaks in 24 batches of Sihuaqingpi samples

2.4 青皮中5个黄酮类成分的含量测定

2.4.1 色谱测定 按“2.2”项下色谱条件进行检测，在该色谱条件下，5个黄酮类成分分离度良好，混合对照品及样品色谱图见图3。

图3 青皮药材的HPLC图谱Fig 3 HPLC chromatogram of Sihuaqingpi

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液10、5、2.5、0.5、0.25 mL，分别置20 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得不同质量浓度的对照品混合溶液，进样测定，以对照品质量浓度（x，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表3。

表3 回归方程、相关系数和线性范围Tab 3 Regressive equation，correlation coefficient and linearity

2.4.3 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液（芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素，质量浓度分别为44.80、287.00、16.80、7.24、5.16 μg·mL-1），连续进样6次，计算得5个成分的峰面积RSD均＜3.4%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取取同一供试品溶液（SHQP-01），分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进行测定，结果供试品溶液中5个成分的峰面积RSD均＜2.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取四花青皮样品（SHQP-01）粉末（过80目筛）6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备，进样测定，结果样品中芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素平均含量分别为10.16、121.50、3.67、3.63、2.21 mg·mL-1，RSD均＜2.9%，说明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收试验 取已知含量的四花青皮（SHQP-01）粉末（过80目筛）约0.1 g，共6份，精密称定，置50 mL量瓶中，每份分别精密加入橙皮苷对照品溶液（1.26 mg·mL-1）10 mL，芸香柚皮苷（0.492 mg·mL-1）对照品溶液2 mL、香蜂草苷（0.356 mg·mL-1）、川陈皮素（0.360 mg·mL-1）、橘皮素（0.242 mg·mL-1）对照品溶液各1 mL，再加甲醇稀释至刻度，按“2.1.2”项下方法制备，进样测定，计算平均回收率，结果芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素的平均加样回收率（n＝6）分别为101.12%（RSD＝2.7%）、100.41%（RSD＝0.91%）、99.11%（RSD＝1.4%）、100.32%（RSD＝2.6%）、98.62%（RSD＝2.4%），表明方法回收率良好。

2.4.7 样品测定 分别取24批四花青皮药材粉末（过80目筛）各2份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取各供试品溶液 10 μL，按“2.2”项下色谱条件进行测定，用外标法计算含量，结果见表4。5个成分中，橙皮苷含量最高，为12.7%，约占5个成分总量的87.6%，且不同产地间的含量差异最小。香蜂草苷平均含量最低，为0.285%，含量范围为0.130%～0.507%，其中四川南充产的3批样品（SHQP-22、SHQP-23、SHQP-24）含量明显高于平均值。芸香柚皮苷、川陈皮素、橘皮素3个成分的含量呈现明显的产地差异性，四川产的4批样品（SHQP-1、SHQP-22、SHQP-23、SHQP-24）中芸香柚皮苷显著高于其他省份，而川陈皮素和橘皮素显著低于其他省份。

表4 四花青皮中5个成分含量测定结果(%，n＝2)Tab 4 Contents of 5 components in Sihuaqingpi (%，n＝2)

3 讨论

3.1 黄酮类成分含量

由试验结果可知，不同批次的青皮样品中各测定成分含量均有不同程度的差异，但橙皮苷和香蜂草苷差异相对较小，而芸香柚皮苷、川陈皮素、橘皮素含量差异与产地密切相关，四川产的4批样品与浙江、江西产的样品差异显著，可能与不同省份栽培品种不同有关。此外，文献报道，青皮生长发育期间，其中物质形成不是简单地从少到多，而是随生长成熟，有的成分在减少，有的成分在增加，表明采收期不同会影响青皮中黄酮类成分的含量[10]，四花青皮中5种成分含量的差异可能与采收期不同有关[3]。因此，加强青皮药材的规范化种植和产地加工的规范化、完善青皮药材的质量标准，对保证青皮药材质量具有重要意义。

3.2 提取方法的优选

本试验对供试品溶液制备的提取方法、提取溶剂、提取时间分别进行了优选。首先进行提取方法（超声、回流）考察，发现在相同的提取时间超声提取法提取率普遍高于回流法；对提取溶剂（50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇）进行比较，发现甲醇的提取率最高；对比了不同超声时间（20、30、40 min）对提取率的影响，结果超声30 min提取率最好。

3.3 检测波长的选择

采用DAD检测器观察190～370 nm下各特征峰的信号高低，最终选择295 nm作为特征图谱的测定波长，在此波长下各特征峰均有较好的信号强度。因5个成分的最大吸收波长不同，芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷最佳测定波长为283 nm，而川陈皮素、橘皮素最佳吸收波长为330 nm，因此选择283 nm和330 nm两个测定波长。

3.4 小结

本试验建立了青皮饮片的特征图谱，并同时测定了不同批次青皮中芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素5个黄酮类成分的含量，该方法简便、准确，具备定性定量双重作用，为有效控制青皮饮片质量提供了研究基础。