通俗环毛蚓、参环毛蚓、赤子爱胜蚓的分子鉴定及纤溶、抗凝活性对比

杨麒琳，马韫楠，杨万青，汪文杰，钟宛凌，樊箫雨，杨天姿，杜守颖，李鹏跃（北京中医药大学 中药学院，北京 100029）

2020年版《中国药典》收录的地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgarisChen（P. vulgaris）、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥体[1]。前一种习称“广地龙”，主产地为广东、广西、海南等；后3种习称“沪地龙”，主产地为上海、江苏、浙江等[2]。我国地龙药材的基原动物主要有14个品种，分别属于钜蚓科（Megascolec-idae）、正蚓科（Lmubricidae）和链胃蚓科（Moniligastridae）5 个属[3]。赤子爱胜蚓Eisenia foetida（Savigny）为正蚓科爱胜蚓属，俗称红蚯蚓，其繁殖率高，适宜人工养殖，是目前世界上养殖最普遍的蚯蚓品种[4]。地龙及混淆品的基原动物种类繁多，且形态极其相似，容易造成品种混杂和掺假的现象[5]。通过 DNA 分子水平进行物种的鉴别是近年来兴起的物种鉴定新方法，在中药材鉴定领域中发挥重要作用。格小光等[6]采集全国多个药材市场的地龙，进行 DNA分子鉴定，与数据库比对，发现 55% 的市售地龙均非药典规定的基原。因此采用 DNA 分子鉴定地龙是有效的手段。

现代研究表明，地龙中含有的化学成分主要有蛋白质、多肽、氨基酸、核苷、有机酸、脂质等[7]，其中地龙内含有的蛋白多肽类成分高达 55%～68%[8]。目前有关赤子爱胜蚓的研究大多集中在其对环境污染物的富集、生物降解等方面[9]。而赤子爱胜蚓不仅在环境保护方面发挥功能，同时也是一种有效的抗血栓药材。赤子爱胜蚓是药典地龙品种之外研究抗血栓活性较多的蚯蚓品种。20世纪 80年代日本学家 Mihara[10]首次从赤子爱胜蚓中分离得到具有纤溶酶活性的蛋白酶，后来研究者们开始研究蚯蚓具有抗血栓功效的蛋白多肽类成分，发现地龙蛋白中的纤维蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓胶原酶对体内凝血系统具有显著的影响，是抗凝血活性物质的主要成分[11]。乙醇沉淀法是纯化蛋白常用方法，是利用蛋白的溶解度进行分离纯化，彭洪兵等[12]对比盐析法和水提醇沉法对地龙蛋白活性的影响，结果表明水提醇沉法的蛋白提取率及纤溶活性均高于盐析法。因此本实验选择药典内的沪地龙品种之一通俗环毛蚓和广地龙的品种参环毛蚓与药典外的赤子爱胜蚓，对比这3种蚯蚓水提液以及乙醇沉淀物的抗血栓活性大小，为今后地龙抗血栓类产品的开发选择蚯蚓品种提供参考。

1 材料

电热恒温鼓风干燥箱（PHGT-9140A），台式高速离心机（5418 R，Eppendorf），超微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo），PCR仪（C1000，Bio-Rad）、电泳仪（PowerPac，Bio-Rad），凝胶成像仪（UVP，Upland），微量移液器（Eppendorf），Milli Q 超纯水机（Millipore），pH计（FE20，Mettler Toledo），恒温空气浴摇床（INNOVA 40R，New Brunswick），匀浆机（QSJ1 型，OIDIRE），电动搅拌器（OES20 型，BNCH），台式离心机（TDL80-2B 型，上海安亭科学仪器厂），Multiscan Go 全波长酶标仪（Thermo Scientific），电子天平（BS224S 型，Sartorius），Sysmex CA500 全自动血凝分析仪（Sysmex）。

鲜体通俗环毛蚓（上海市地龙养殖基地），鲜体赤子爱胜蚓（天津市蚯蚓培养基地），鲜体参环毛蚓（广西蚯蚓养殖基地），基因组提取试剂盒Mollusc DNA Kit D3373（OMEGA Bio-tek，America），Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、5minTM TA /Blunt-Zero Cloning Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、Fast-T1 化学感受态细胞C505-02/03（Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司），无水乙醇（Fisher），氯仿（北京科华经纬科技有限公司），异戊醇（X1，西陇化工股份有限公司），氯化钠、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司），Tris、EDTA（Bioruler，America），冰醋酸（北京化工股份有限公司），Tryptone、Yeast Extract（OXOID），琼脂糖（Biowest Agarose，北京拜尔迪生物有限公司），6x SuperStain Loading Buffer（北京康为试剂生物科技有限公司），Agar粉（北京索莱宝科技有限公司），氨苄青霉素钠（北京百瑞极生物科技有限公司），COI通用引物（COI-F：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，COI-R：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，Tm 值为 54），纤维蛋白原（牛血）（批号：140607-202042）、凝血酶（牛血）（批号：140606-201826）、蚓激酶（批号：140650-201703）（中国食品药品检定研究院），生理盐水（山东华鲁制药有限公司，批号：SD21061115），琼脂糖（上海贝晶），药用级95%乙醇。

2 方法

2.1 3种蚯蚓的分子鉴定

2.1.1 蚯蚓DNA的提取 在研钵中放入活体蚯蚓2 cm的肌肉组织，加入液氮冷冻，快速研磨成粉，按照软体动物基因组提取试剂盒（Mollusc DNA Kit D3373）说明书提取蚯蚓基因组 DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并通过NanoDrop 2000 进行浓度及纯度检测。

2.1.2 PCR扩增及产物检测 根据PCR扩增试剂盒（Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit）说明书加入通用引物、DNA 和试剂，PCR的反应程序以50 µL反应体系建立，具体程序见表1。1% 琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，将扩增产物连接至质粒，转化至大肠埃希菌，将菌液送华大基因进行测序。测序完成后，将克隆的基因片段在National Center for Biotechnology Information（NCBI）中进行 BLAST 搜索比对。

表1 PCR反应程序Tab 1 PCR reaction procedure

2.2 3种蚯蚓水提液及乙醇沉淀物的纤溶、抗凝活性对比

2.2.1 3种蚯蚓水提液的制备 将鲜体蚯蚓切碎，用打浆机制成蚯蚓泥，加4倍量纯水，匀浆处理，离心（4000 r·min-1，15 min），收集上清液，稀释适当倍数至检测范围内作为测试样品。

2.2.2 3种蚯蚓乙醇沉淀物的制备 取鲜体蚯蚓制备的水提液，加定量 95% 乙醇，调至乙醇浓度为80%，静置后收集沉淀，冻干。称取 10 mg 乙醇沉淀物加 10 mL 生理盐水溶解，稀释适当倍数至检测范围内作为测试样品。

2.2.3 纤维蛋白平板法评价纤溶活性 参考刘涛等[13]利用纤维蛋白平板法，以尿激酶为标准品测定地龙中蛋白酶的活性，本实验采用蚓激酶作为标准品。取一次性平皿，加入0.5 mL凝血酶（40 BP·mL-1）。将8 mL纤维蛋白原（2 mg·mL-1）与10 mL的琼脂糖溶液（5 mg·mL-1）迅速混合后加入皿中，轻轻摇匀，室温水平放置1 h后打孔，分别吸取10 μL浓度为4000、6000、8000、10 000、12 000、16 000 U·mL-1的标准品蚓激酶以及“2.2.1”项下制得的测试样品进行点样加盖，置37℃恒温箱中孵育18 h，取出，测量溶圈垂直两直径，以标准品蚓激酶单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，绘制回归方程，计算样品效价单位数作为纤溶活性，利用公式1计算纤溶比活（U·µg-1）。

公式 1：纤溶比活（U·µg-1）＝纤溶活性（U·mL-1）/蛋白浓度（µg·mL-1）

2.2.4 Fibg-TT法评价抗凝活性 参考吴娅丽等[14]利用全自动血凝分析仪测定纤维蛋白原-凝血酶时间（Fibg-TT）来评价地龙及其相关制剂的体外抗凝活性。以生理盐水为空白对照，测定系列浓度的标准品蚓激酶液（250、500、1000、1500、2000 U·mL-1）和测试样品，以标准品蚓激酶的单位数为横坐标，以系列浓度标准品蚓激酶 Fibg-TT 的对数与空白组 Fibg-TT 的对数的差值为纵坐标，绘制标准曲线，得样品效价单位数作为抗凝活性，利用公式 2 计算抗凝比活（U·µg-1）。

公式2：抗凝比活（U·µg-1）＝抗凝活性（U·mL-1）/蛋白浓度（µg·mL-1）

2.3 蛋白含量测定

采用BCA法测定蚯蚓蛋白含量，测试样品用酶标仪进行测定，以系列浓度BSA蛋白标准溶液作标准曲线计算蛋白含量。

2.4 SDS-PAGE 凝胶电泳

采用 SDS-PAGE检测3种蚯蚓乙醇沉淀物的分子量，每个样品上样 10 µL。采用 12% 电泳预制胶，电压为 150 V，电泳结束后用考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液染色，最后用纯水脱色至背景清晰，重复2次。

2.5 数据处理

每种蚯蚓从提取到测试重复 3 次，结果用平均值±标准差表示，采用 SPSS 20.0 软件对数据进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 3种蚯蚓的分子鉴定结果

3.1.1 蚯蚓 DNA 的提取、PCR 扩增 对3种蚯蚓提取的 DNA 进行琼脂糖电泳检测，DNA 条带均清晰明亮，无弥散情况，如图 1。3种蚯蚓提取的 DNA 的A260/280均在 1.8～2.0，表明提取的DNA 纯度较高，无蛋白质污染。利用通用引物COI对3种蚯蚓提取的 DNA 片段进行 PCR 扩增，扩增产物的条带均呈现整齐、单一明亮的条带，如图 2。

图1 3种蚯蚓提取的 DNA 的琼脂糖电泳Fig 1 Agarose electrophoresis of DNA of the three earthworms

图2 3种蚯蚓 PCR产物的琼脂糖电泳Fig 2 Agarose electrophoresis of PCR products of the three earthworms

3.1.2 PCR 产物测序分析 去除载体 TOPO 序列及引物端可知扩增的COI基因片段大小分别是：参环毛蚓为 709 bp、赤子爱胜蚓为 768 bp、通俗环毛蚓为 765 bp。BLAST 相似性比对结果显示本实验3种蚯蚓都能成功匹配上对应物种。其中本实验样品通俗环毛蚓与 NCBI 基因库中报道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的为通俗腔蚓（Metaphire Vulgaris）线粒体基因COIKF205980.1，相似度为 99.27%。通俗腔蚓与通俗环毛蚓为同名异物现象，该现象是由于蚯蚓分类系统的改进而出现的结果[15]。本实验样品赤子爱胜蚓与 NCBI 基因库中报道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的为赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）线粒体基因COILC006114.1，相似度为98.87%。本实验样品参环毛蚓与 NCBI 基因库中报道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的为参环毛蚓（Pheretima aspergillum）线粒体基因COIMN729554.1，相似度为 99.85%。

3.2 3种蚯蚓水提液的纤溶、抗凝活性对比

计算3批参环毛蚓、通俗环毛蚓、赤子爱胜蚓水提液的纤溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比，具体结果如表 2 所示。3种蚯蚓的水提液纤溶比活用单因素方差分析检验，LSD 法进行两两比较，F＝1753.750，P＜0.05；3种蚯蚓的水提液抗凝比活用单因素方差分析检验，LSD 法进行两两比较，F＝274.35，P＜0.05。因此3种蚯蚓水提液的纤溶比活之间与抗凝比活之间的差异有统计学意义。结果显示参环毛蚓水提液的纤溶比活和抗凝比活最强，通俗环毛蚓次之，赤子爱胜蚓水提液的纤溶比活和抗凝比活远远小于参环毛蚓和通俗环毛蚓，而赤子爱胜蚓水提液的蛋白含量最高。

表2 参环毛蚓、通俗环毛蚓、赤子爱胜蚓水提液的纤溶比活、抗凝比活与蛋白含量(n＝3)Tab 2 Specific activity of fibrinolysis，specific activity of anticoagulation and protein content of water extracts from Pheretima aspergillum，Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n＝3)

3.3 3种蚯蚓乙醇沉淀物的纤溶、抗凝活性对比

3批参环毛蚓、通俗环毛蚓、赤子爱胜蚓乙醇沉淀物的纤溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比结果见表 3。3种蚯蚓的乙醇沉淀物纤溶比活用单因素方差分析检验，LSD 法进行两两比较，F＝1053.967，P＜0.05；3种蚯蚓的乙醇沉淀物抗凝比活用单因素方差分析检验，LSD 法进行两两比较，F＝127.904，P＜0.05。因此3种蚯蚓乙醇沉淀物的纤溶比活之间和抗凝比活之间的差异有统计学意义。结果参环毛蚓乙醇沉淀物的纤溶比活最强，通俗环毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最强，赤子爱胜蚓的纤溶比活、抗凝比活、蛋白含量均小于参环毛蚓和通俗环毛蚓。

表3 参环毛蚓、通俗环毛蚓、赤子爱胜蚓乙醇沉淀物的纤溶比活、抗凝比活与蛋白含量(n＝3)Tab 3 Specific activity of fibrinolysis，specific activity of anticoagulation and protein content of ethanol precipitates from Pheretima aspergillum，Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n＝3)

3.4 SDS-PAGE 结果分析

重复2次结果一致性较好，典型图谱见图3，通俗环毛蚓与参环毛蚓乙醇沉淀物的条带集中在25～70 kDa，但条带分布有所差异，而赤子爱胜蚓乙醇沉淀物的条带集中在 25～40 kDa，条带数量较前两种蚯蚓少。其中参环毛蚓乙醇分级沉淀物在 55～70 kDa分布一个较为清晰的条带，通俗环毛蚓乙醇分级沉淀物在 25～35 kDa 分布一个较为清晰的条带。3种蚯蚓的乙醇分级沉淀物均在 10～15 kDa 有一条较宽的条带。

图3 3种蚯蚓乙醇沉淀物的 SDS-PAGE 图Fig 3 SDS-PAGE of ethanol precipitates from three earthworms

4 讨论

虽然形态鉴定是传统鉴定方法，但地龙的外表形态特征相似，仅通过形态鉴定无法确定品种，容易受主观因素影响，且混杂品种较多，采用 DNA 分子鉴定可以更准确、高效地鉴定地龙品种。本实验运用基于COI基因对鲜体地龙进行DNA 分子鉴定，序列结果与 NCBI 中的基因库对比，与已知地龙品种的序列相似度均在 98% 以上，以此相似度可确定品种，有效鉴定出参环毛蚓、通俗环毛蚓和赤子爱胜蚓。

不同地龙含有的抗血栓活性蛋白有所区别，抗血栓的能力也有差别。本研究结果表明，参环毛蚓的水提液抗凝比活和纤溶比活最强；参环毛蚓乙醇沉淀物的纤溶比活最强，而通俗环毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最强；赤子爱胜蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝比活和纤溶比活都远小于前两者。赤子爱胜蚓中发挥抗血栓作用的主要是蚓激酶，这说明药典内的两种地龙体内含有除蚓激酶之外独特的蛋白，其具有较高的抗血栓活性。通过纵向对比，蚯蚓乙醇沉淀物的抗凝比活与纤溶比活均强于蚯蚓的水提液，可知通过乙醇沉淀法可以有效纯化富集抗血栓地龙蛋白。

参环毛蚓的水提液抗凝活性更强，而通俗环毛蚓的乙醇沉淀物抗凝活性更强，可能因为通俗环毛蚓水提液中含有非抗凝血蛋白和非蛋白物质含量较高，且杂蛋白中可能有促凝血的蛋白，用乙醇纯化后，去除了部分杂质，使得通俗环毛蚓中抗凝蛋白能更充分地发挥其作用。同时也说明地龙蛋白是主要具有抗凝活性的物质，且纯度越高作用越明显。赤子爱胜蚓用水提取后的蛋白含量在三者间最高，再用乙醇纯化后蛋白含量反而最低，推测赤子爱胜蚓体内含有大量非抗血栓活性蛋白和非蛋白物质，或者用乙醇纯化赤子爱胜蚓蛋白效率较低，应该另寻找更适合的纯化方法。

3种蚯蚓乙醇沉淀物在 25～40 kDa 均有较明显的条带，说明地龙具有抗血栓活性的独特蛋白分子量分布于此，但条带分布有明显差异，说明3种蚯蚓中具有抗血栓活性蛋白有所差异。

从本研究结果可看出，药典内的两种蚯蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝活性和纤溶活性都远强于赤子爱胜蚓，而目前研究较多的是药典以外的蚯蚓品种（赤子爱胜蚓、粉正蚓）等，关于药典内的地龙研究较少，且通俗环毛蚓和参环毛蚓分布广，数量多，因此深入研究药典内地龙的基原蚯蚓的抗血栓活性蛋白具有重大意义。本实验仅研究了3种蚯蚓水提液和乙醇沉淀物的纤溶和抗凝活性，后续可进一步纯化参环毛蚓和通俗环毛蚓蛋白的抗血栓活性部位，研究其体内外的活性及物质基础。