基于UPLC-Q-TOF-MS技术的不同产地肺形草化学成分的研究

张忠立，石文康，左月明，吴华强（江西中医药大学药学院，南昌 330004）

《中华本草》收载了龙胆科双蝴蝶属植物肺形草、青鱼胆草、黄金线、台湾肺形草、小筋骨藤5 种中草药[1]，其中肺形草来源于龙胆科植物双蝴蝶[Tripterospermum chinense（Migo）H. Smith]的幼嫩全草，主要分布于江西、福建、湖北等地，味甘、性寒，归肺、肾经，具有清肺止咳、凉血止血、利尿解毒等功效[2]。国内外研究主要集中在玉山双蝴蝶、日本双蝴蝶、双蝴蝶和台湾双蝴蝶等几种植物，目前已从双蝴蝶属植物中分离得到100多个化合物，主要含有环烯醚萜类和黄酮类（呫吨酮）等成分[2-4]，现代药理学研究证明其具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗禽流感病毒、抑菌等作用[4-6]。本课题组前期依据“肺脾两虚，痰瘀内阻”的中医病机，建立肺脾两虚型慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）病理模型，利用此模型研究发现肺形草提取物具有治疗COPD的生物活性，故本实验以不同产地的肺形草为研究对象，采用超高效液相-四极杆-飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）测定不同产地样本，运用多种统计方法分析不同产地肺形草所含化学成分的差异性，以提供较全面的肺形草技术资料，促进肺形草资源的合理利用和开发。

1 材料

1.1 仪器

Nexera X2 LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本岛津公司），Triple TOF 5600+型高分辨质谱（美国AB SCIEX公司，配备Analyst 1.6数据处理软件），BT255十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），GZX-9070ME数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试药

不同产地的肺形草药材样品F1～F8（见表1）均采自于7～8月份，经江西中医药大学中药鉴定教研室左月明教授鉴定为龙胆科双蝴蝶属植物Tripterospermum chinense（Migo）H.Smith.的干燥全草。水为屈臣氏蒸馏水，甲酸、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

表1 不同产地肺形草药材样品信息Tab 1 Sample sources of the herba of Tripterospermum chinense in different areas

2 方法与结果

2.1 液相检测条件

Welchrom HPLC C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱，洗脱条件：0～2 min，5%A；2～20 min，5%～12%A；20～35 min，12%～40%A；35～38 min，40%A；38～48 min，40%～80%A；48～50 min，80%A。流速为0.3 mL·min-1，进样室温度为 15℃，柱温为35℃，进样量为2 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，扫描范围m/z100～1250，喷雾电压5.5 kV，离子源500℃，去簇电压100 V，碰撞能量35 eV，数据采集时间50 min。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取干燥肺形草粉末（过三号筛）1.0 g，加入70%甲醇，质量体积比为1∶25，回流提取3次，每次2 h，放冷，用70%甲醇补足失重，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即可。

2.4 化学成分鉴定

利用UPLC-Q-TOF-MS系统，按照保留时间的先后顺序采集肺形草中化学成分的相关质谱数据，对样品溶液分析得不同产地药材基峰离子色谱图，见图1。通过在中国知网（CNKI）、SciFinder、Mass bank等数据库查找收集肺形草中含有的化学成分（包括化学名称、CAS号、分子式和分子量），在软件PeakView 1.2.0.3中导入化合物的名称和分子式，保留筛选出的化学式和保留时间等必要的信息，再导入查找到化学式的mol式，与二级碎片和化学结构进行对比匹配，结合化学式裂解的基本规律和匹配度≥90%辨别成分；或者结合保留时间和文献中的质谱信息综合鉴定成分[7-31]，共鉴定出肺形草化学成分51个（见表2），主要为环烯醚萜和黄酮类成分。

图1 不同产地肺形草基峰色谱图（BPI）Fig 1 Chromatogram of the base peaks of Tripterospermum chinense in different areas

表2 肺形草负离子模式色谱峰质谱指认Tab 2 Identification of chemical constituents from the herba of Tripterospermum chinense by negative ion mode

续表2

2.4.1 环烯醚萜类成分鉴定 峰3在负离子峰模式下m/z355.1035，分子式为C16H20O9，在丢失中性碎片-C6H10O5-CO2得到m/z149.0178，再继续丢失-C2H4O2得到m/z89.0351，与参考文献[9]比对得知，此化合物为龙胆苦苷。峰8在负离子峰模式下m/z375.1296，分子式为C16H24O10，丢失-C6H10O5得到碎片离子m/z213.0769，再失去一分子-CO2得到碎片离子m/z169.0873，丢失一分子-H2O得到碎片m/z151.0766，见图2。根据二级碎片离子结合参考文献[9]推测出此化合物为马钱苷酸。

图2 马钱苷酸的裂解方式Fig 2 Proposed fragmentation pathways of loganic acid

2.4.2 呫吨酮类成分鉴定 峰18在负离子峰模式下m/z421.0769，分子式为C19H18O11，继而丢失中性碎片-H2O，-C3H6O3，-C4H8O4，-C6H10O5，生成m/z403.0129，331.0470，301.0364和259.0259碎片离子，碎片离子m/z331.0470丢失-CO-H2O得到离子m/z285.0411，碎片离子m/z301.0364丢失-CH2O得到碎片离子m/z271.0254，见图3。与参考文献[21]比对得知，此化合物为芒果苷。峰35在负离子峰模式下m/z273.0406，分子式为C14H10O6，丢失一分子-CH3得到碎片离子m/z258.0171，或者丢失一分子-CO2得到碎片离子m/z229.0229。与参考文献[9]对比得知，此化合物为雏菊叶龙胆酮。峰38在负离子峰模式下m/z259.0249，分子式为C13H8O6，一个羟基键断裂，得到m/z243.0581，在双苯基-γ-吡喃酮的母核上发生杂环的碳氧化学键断裂，得到碎片离子m/z199.0852。结合文献[9]推测出此化合物为去甲基雏菊叶龙胆酮。

图3 芒果苷的裂解方式Fig 3 Proposed fragmentation pathways of mangiferin

2.4.3 黄酮类成分鉴定 峰22在负离子峰模式下m/z461.1103，分子式为C22H22O11，母离子发生RDA反应，丢失-C4H8O4生成了m/z341.0368的碎片，随后又丢失-CO及CH3得到碎片m/z313.0258和m/z298.0402。通过参考文献[18]比对，得出此化合物为日当药黄素。

峰23在负离子峰模式下m/z447.0924，分子式为C21H20O11，丢失碎片-C6H10O5，-C4H8O4，-C3H6O3，生成m/z285.0681，327.0522和357.0621碎片离子，m/z357.0621离子碎片再丢失一分子水得m/z339.0582，m/z327.0522离子碎片再丢失一分子水得m/z309.0692，见图4。通过参考文献[22]比对，得出此化合物为异荭草苷。

图4 异荭草苷的裂解方式Fig 4 Proposed fragmentation pathways of isoorientin

2.4.4 生物碱类成分鉴定 峰20在负离子峰模式下m/z174.0563，分子式为C10H9NO2，丢失一分子-HCHO得到碎片离子m/z144.0621，再丢失一分子-CO得碎片离子m/z116.0662，见图5。通过参考文献[9]比对，得出此化合物为龙胆碱。

图5 龙胆碱的裂解方式Fig 5 Proposed fragmentation pathways of gentianine

2.4.5 三萜类成分鉴定 峰49在负离子峰模式下m/z455.3534，分子式为C30H48O3，丢失一分子-HCOOH得到碎片离子m/z409.0132，再丢失一个-H2O和RDA裂解后得到碎片离子m/z350.0721，或者原分子丢失一个-H2O得到碎片离子m/z437.0692，或者原分子发生RDA裂解后得到碎片离子m/z207.2688，再丢失一分子-H2O得到碎片离子m/z189.0126，见图6。通过与参考文献[31]进行对比，得出此化合物为熊果酸。

图6 熊果酸的裂解方式Fig 6 Proposed fragmentation pathways of ursolic acid

2.4.6 蒽醌类成分鉴定 峰46在负离子峰模式下m/z269.0455，分子式为C15H10O5，丢失一分子-CO得到碎片离子m/z241.0515，进一步丢失一个-O得到碎片离子m/z225.0565，而后丢失一分子-CO得到m/z197.0606；或者m/z241.0515碎片丢失一分子-CO得到m/z213.0562，再丢失一分子CO得到m/z185.0585，继续丢失一分子CH2得到m/z171.0458，见图7。通过与参考文献[13]比对，得出此化合物为大黄素。

图7 大黄素的裂解方式Fig 7 Proposed fragmentation pathways of emodin

2.4.7 有机酸类成分鉴定 峰21在负离子峰模式下m/z179.0348，分子式为C9H8O4，丢失一分子-CO2得到m/z135.0459。通过与参考文献[19]比对，得出此化合物为咖啡酸。

2.5 主成分分析

将不同产地的肺形草化学成分存在差异，主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）将不同产地的肺形草MS数据导入MarkView 1.2.1并设置参数，去除同位素离子峰，归一化处理后得到数据。将得到的数据导入SIMCA 14.1进行PCA和OPLS-DA分析。数据在软件中经过处理可以得到PCA图。结果发现不同产地的样本被明显分为三类，说明样本之间的化学成分有明显的差异，F3样本为一组，F2和F6样本为一组，F1、F4、F5、F7和F8样本为一组，每组组内样本之间离散较小，表示组内均一性良好。PCA虽然可以将样本进行分类，但是组内差异并不明显，所以在PCA的基础上进行OPLS-DA分析，结果发现组间差距依旧明显，组内也存在差异（见图8）。聚类分析结果显示：如果将样本分为两类，F2、F3、F6为一类，F1、F4、F5、F7、F8为一类；如果将样本分为4类，则F3为一类，F2、F6为一类，F5、F8为一类，F1、F4、F7为一类，见图9。

图8 不同产地肺形草的PCA 得分（A）和 OPLS-DA 得分（B）Fig 8 PCA scores（A）and OPLS-DA scores（B）of Tripterospermum chinense in different areas

图9 不同产地肺形草的聚类分析Fig 9 Cluster analysis of Tripterospermum chinense in different areas

2.6 差异性成分的筛选与分析

将不同产地肺形草数据导入MarkView 1.2.1中设置参数，去掉同位素离子峰后再进行t检验，导出数据保留Use一列中的Ture数据；结合OPLS-DA中VIP＞1的值与t检验中P＜0.05的值取交集，对照所有的数据共得到11个差异性指标成分，将每个产地的峰面积进行对比，结果见表3。

表3 不同产地肺形草存在差异的化合物信息Tab 3 Compound information of differences of Tripterospermum chinense in different areas

不同产地的肺形草药材中，化学成分种类差别不大，均以黄酮和环烯醚萜类成分为其主要成分类型，而有11个差异性成分的相对含量不同，马钱苷酸、8-表-金银花苷、莫诺苷和芒果苷在肺形草药材中相对含量较高。1，3，8-三羟基呫吨酮和3，6，8-三羟基-1-甲基呫吨酮在F6样本中含量较高，大黄素和莫诺苷在F8样本中含量较高，芒果苷在F5样本中含量较高，马钱苷酸、8-表-金银花苷、当药黄素、熊果酸、山楂酸和千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在F3样本中含量较高。

3 讨论

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS对不同产地肺形草的化学成分进行辨识，前期正、负离子模式比较发现，黄酮类和环烯醚萜类成分在负离子模式下所显示的成分信息更多。同时，我们对色谱条件进行优化，对提取方法、提取时间以及流动相等进行了考察，最终确定以70%甲醇为提取溶剂，回流提取2 h，流动相采用乙腈-0.1%甲酸水进行负离子模式下梯度洗脱测试，共鉴别出51个化合物，其中以黄酮、呫吨酮和环烯醚萜类成分为主，最终筛选出大黄素、芒果苷、莫诺苷等11个差异性成分，这些差异性成分相对含量的不同直接反映不同产地肺形草药材质量的差异性，产于江西、浙江、福建的肺形草药材成分相近，产于四川和云南的肺形草药材成分相近，而产于湖北的肺形草单独为一组。由于目前化学成分数据库尚不完善和相关领域研究报道较少，导致部分成分没有最终鉴定，有待后续进一步深入研究。

国内外对双蝴蝶属植物的化学成分和药理活性的研究显示，双蝴蝶属植物中的化学成分多属于环烯醚萜类和呫吨酮类成分，大多具有非常广泛的药理活性，其中马钱苷酸和8-表-金银花苷具有抗炎作用[4]，莫诺苷具有保护神经元延缓衰老、保肝作用[32]，芒果苷具有抗炎、抗心力衰竭作用[33]，当药黄素具有抗炎、抗氧化和抗抑郁作用[34]，研究表明肺形草具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗病毒、抑菌等作用。本课题组前期研究发现肺形草提取物具有治疗COPD的生物活性，但其药效物质基础不清晰，有待进一步深入探讨。此外，肺形草不同产地药材中环烯醚萜类和呫吨酮类差异性成分相对含量的不同，导致药材质量的不稳定，需要以此类差异性成分为定量指标建立和完善肺形草药材的质量标准，故通过本文研究，可为后续药材质量标准的制定提供科学依据和理论支撑，以促进其资源的合理利用和深度开发。