酒黄精总黄酮提取工艺及其抗氧化作用研究

薛妙，郭凯丽，袁盼盼，刘继平，史永恒，过晓芳，王斌，朱星枚，，*（. 陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 706；. 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 706；. 陕西省中医药管理局中药药效机制与物质基础重点研究室，陕西 咸阳 706；. 西安工业大学数理系，西安 700）

酒黄精收录于2020年版《中国药典》黄精（Polygonati Rhizoma）项下，由净黄精经酒炖或酒蒸制得，主补气养阴，健脾，润肺，益肾[1]。现代药理学研究表明黄精具有调节血脂血糖、增强免疫、抗氧化、抗衰老等多种药理活性[2-4]，而酒黄精在滋阴养肾、抗氧化、提高免疫等方面较黄精生品作用更强[5-7]，因此酒黄精具备更广阔的天然产物开发市场，但是目前对酒黄精化学成分研究偏少，功效物质及机制尚不清楚。本研究拟通过响应面法优化酒黄精总黄酮的提取工艺，并探讨其抗氧化作用及对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用。

1 材料

1.1 试药

酒黄精购自陕西西安万寿路中药材市场，由陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为酒黄精。芦丁对照品（纯度≥97%，批号：C06M11Y112461）、维生素C（VC，纯度≥99%，批号：S19J6G1）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，纯度≥99%，批号：Y17A9Y307695）（上海源叶）；纤维素酶（批号：191125）（上海蓝季生物）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、羟基自由基、总还原能力（ABTS+）、MDA、GSH-Px、SOD检测试剂盒（南京建成）；其他试剂（分析纯，天津科密欧）。

1.2 仪器

KS-500DV液晶超声波清洗器（昆山洁力美）；BSA224S分析天平（精度：0.0001 g）、pH酸度计（北京赛多利斯）；TDZ5-WS低速离心机（湖南湘仪）；TY2021000834全波长酶标仪（美国伯腾）。

1.3 细胞及动物

KM小鼠40只，体质量25～35 g，雄性[成都达硕，动物合格证号SCXK（川）2020-030]。动物实验经陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准（SUCMDC 20210310009）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮提取液的制备

酒黄精经干燥粉碎后过6号筛备用。精密称取酒黄精粉末2.00 g，加入10 mL乙醇溶液至锥形瓶中，充分溶解，用0.1 mol·L-1的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH为4.8。称取适量纤维素酶，40℃水浴中活化30 min。50℃超声提取结束后沸水浴灭活10 min，趁热过滤，上清液用乙醇溶液定容至10 mL，备用。

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[8]测定总黄酮含量。用色谱甲醇溶解芦丁对照品制成0.2 mg·mL-1的对照品储备液。精密吸取芦丁对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL量瓶中，依据文献[9]以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线y＝10.24x+0.0272（R2＝0.9976），线性范围为0.0080～0.0480 mg·mL-1。

2.2.2 样品中总黄酮含量的测定 精密吸取“2.1”项下提取液1.0 mL，依“2.2.1”项下方法测定黄精总黄酮提取液的吸光度，代入标准曲线后，计算总黄酮提取率。

总黄酮提取率（%）＝（总黄酮质量浓度×药液体积）/ 药材质量×100%。

2.3 统计分析

采用GraphPad Prism 7.0进行数据分析，Oneway Analysis of Variance（ANOVA）比较多组间差异，t检验比较两组间差异，P＜0.05时差异具有统计学意义。

2.4 响应面法优化提取黄精总黄酮的最佳工艺

2.4.1 单因素实验 依“2.1”项下方法，超声提取，分别考查纤维素酶用量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%），乙醇浓度（45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%），料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL），提取时间（5、10、15、20、25、30、35、40、45 min）对总黄酮提取率的影响。各单因素结果见图1。初步确定最佳条件分别为纤维素酶用量为2.5%，乙醇浓度为55%，提取时间为15 min，料液比为1∶15（g/mL）。

图1 单因素对酒黄精总黄酮提取率的影响Fig 1 Influence of single factors on the yield of total flavonoids of alcoholic polygonatum

2.4.2 响应面法优化实验设计及结果 依据Box-Behnken中心组合的实验设计原理，针对“2.4.1”单因素实验结果，选取纤维素酶用量（A）、乙醇浓度（B）、料液比（C）、提取时间（D）为变量因素，以总黄酮提取率（Y）为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法进行测试，各因素水平见表1，实验结果见表2。利用Design Expert 10.6.4软件对数据进行回归拟合，得到总黄酮提取率Y对以上4个因素的二次多项回归模型：Y＝116-0.36A-6.63B+31.08C+2.6D+2.01AB-2.51AC+2.23AD+3.73BC-1.89BD-2.99CD-0.12A2-2.47B2-24.33C2-1.31D2。方差分析见表3。

表1 响应面实验因素及水平Tab 1 Factor and level of response surface experiment

表2 响应面实验设计及结果Tab 2 Response surface design and experimental results

从表3中可看到，回归模拟方程中，一次项乙醇浓度（B），料液比（C），二次项料液比（C2）对总黄酮提取率具有显著影响。各因素之间的互作关系通过响应面曲面分析图展示（见图2），曲面越陡，其对提取率影响越显著。由此可见料液比是酒黄精总黄酮提取率的决定因素。

图2 酒黄精总黄酮提取工艺各影响因素互作图Fig 2 Influence of different factors on the yield of total flavonoids of alcoholic polygonatum

表3 方差分析结果Tab 3 Analysis of variance

2.4.3 最佳工艺确定及验证 经Design Expert 10.6.4软件分析，最优工艺为纤维素酶用量1.5%，乙醇浓度45%，提取时间15.879 min，料液比1∶21.028（g/mL），根据实际情况校正酒黄精总黄酮最佳提取工艺为：纤维素酶用量1.5%，乙醇浓度45%，提取时间16 min，料液比1∶21（g/mL）。并进行3次平行实验验证，结果最优工艺下酒黄精总黄酮提取率为0.119%，RSD＝0.58%。表明该工艺简便可行，重复性好。

2.5 体外抗氧化作用研究

2.5.1 溶液配制与分组 ABTS工作液的配制：将7 mmol·L-1ABTS溶液和140 mmol·L-1过硫酸钾水溶液按50∶1混合，避光反应16 h，用乙醇稀释到A732nm约0.7备用。

各实验设置样品组（As，加入样品的 DPPH无水乙醇溶液），样品对照组[Abs，加入乙醇（蒸馏水）的提取液]，空白对照组（Abc，等体积无水乙醇（蒸馏水）代替样品的DPPH（羟自由基工作液，ABST溶液），阳性对照组（VC或BHT）。每组实验重复3次。

2.5.2 DPPH自由基清除能力的测定 精密吸取不同浓度酒黄精总黄酮溶液100 μL，加0.1 mmol·L-1DPPH无水乙醇溶液100 μL，混匀，室温避光30 min，517 nm测定A值，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率（%）＝[1-（As-Abs）/Abc]×100%。

2.5.3 羟基自由基清除能力的测定 精密吸取不同浓度酒黄精总黄酮溶液50 μL，依次加入50 μL 6 mmol·L-1FeSO4、100 μL 6 mmol·L-1H2O2，充分摇匀后室温放置10 min；再加入50 μL 6 mmol·L-1水杨酸，充分摇匀后室温放置30 min，510 nm测定A值，计算羟自由基清除率。羟自由基清除率（%）＝（Abs-As）/Abs×100%。

2.5.4 ABTS总抗氧化能力的测定 精密吸取不同浓度酒黄精总黄酮溶液50 μL，加入100 μLABTS，避光10 min，734 nm测定A值，计算总抗氧化能力。总抗氧化能力（%）＝[1-（As-Abs）/Abc]×100%。

结果如图3所示，酒黄精总黄酮具有较强的抗氧化能力，可以剂量依赖性地清除DPPH、羟自由基和ABTS自由基，其IC50分别是（19.43±0.96）μg·mL-1、（4.46±0.14）μg·mL-1和（31.57±0.14）μg·mL-1，尤其是对羟自由基具有较VC [IC50＝（22.23±0.99）μg·mL-1]和BHT [IC50＝（54.83±0.95）μg·mL-1]更强的清除能力。其对ABTS的清除能力在低浓度时较VC低，但当浓度达到100 μg·mL-1时，作用比BHT强，与VC相当。

图3 酒黄精总黄酮体外抗氧化能力Fig 3 In vitro antioxidant capacity of total flavonoids from alcoholic polygonatum

2.6 酒黄精提取物对顺铂诱导小鼠急性肾损伤的保护作用

2.6.1 顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型制备 依文献方法[9]单日腹腔注射顺铂（20 mg·kg-1）建立小鼠急性肾损伤模型。

2.6.2 分组及给药 将40只雄性KM小鼠随机分为空白组，模型组，酒黄精低、中、高剂量组（3.08、9.25、27.74 mg·kg-1），每组8只。空白组、模型组连续灌胃7 d生理盐水，酒黄精组（参照2020年版《中国药典》方法换算小鼠等效剂量3.08 mg·kg-1）连续灌胃7 d提取物。除空白组外，每组小鼠按0.02 mL·g-1腹腔注射顺铂。空白组腹腔注射等量生理盐水。

2.6.3 血清和肾组织中丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的检测 对实验后的小鼠进行眼球取血，3000 r·min-1离心20 min获得血清。取肾组织和生理盐水按1∶9制备成10%的肾组织匀浆，匀浆于离心机12 000 r·min-1离心10 min，取上层清液，BCA蛋白浓度试剂盒测定肾脏组织蛋白浓度。依次对血清、肾组织按试剂盒说明书步骤，通过比色法在酶标仪上532 nm（450 nm、412 nm）处检测并计算MDA（SOD、GSHPx）含量。与空白组比较，模型组小鼠氧化应激与抗氧化失衡，表现为血清和肾组织MDA显著升高（P＜0.01），SOD和GSH-Px显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，酒黄精组血清和肾组织MDA含量降低（P＜0.01，P＜0.05），SOD和GSH-Px含量升高（P＜0.01，P＜0.05）。表明不同剂量酒黄精总黄酮提取物能减轻顺铂诱导小鼠急性肾损伤氧化应激水平（见图4）。

图4 不同剂量酒黄精总黄酮对顺铂诱导急性肾损伤小鼠血清、肾组织中MDA、SOD、GSH-Px的影响Fig 4 Effect of different dosages of total flavones of alcohol from alcoholic polygonatum on MDA，SOD，GSH-Px in the serum and renal tissue of mice with acute renal injury induced by cisplatin

2.6.4 病理学检测 取实验后的小鼠肾脏，经过4%多聚甲醛固定，脱水透明后石蜡包埋，取肾脏切片进行HE染色，在显微镜下观察肾小管及周围细胞变化。

模型组中观察到急性肾损伤组织肾小管上皮细胞颗粒或空泡样变形，官腔扩张，刷状缘脱落，可看到基底膜断裂，官腔内可见透明、颗粒或细胞管型，有上皮细胞凋亡现象。而酒黄精提取物组肾小管空泡样变形，上皮细胞颗粒均较模型组缓解，肾小管上皮脱落减轻，管腔内脱落的细胞核固缩上皮细胞明显减少（见图5）。

图5 酒黄精总黄酮对顺铂诱导急性肾损伤的影响Fig 5 Effect of total flavonoids from alcoholic polygonatum on acute renal injury induced by cisplatin in mice

3 讨论与结论

课题组前期实验表明，黄精总黄酮具有抗氧化、抗非小细胞肺癌增殖活性[10]。黄精含有多糖、皂苷、黄酮、蒽醌及氨基酸等活性成分，酒制后多糖和总酚含量降低，皂苷、黄酮和蒽醌含量升高[11]。故本研究首次利用响应面法优化酒黄精总黄酮的提取工艺，使总黄酮提取率为0.119%，显著高于基于黄精原药材（0.01%）的黄酮得率[10]。验证实验表明该工艺方法可靠，重复性高（RSD＝0.58%）。黄精具有益肾健脾、补气养阴等功效，而肝肾阴虚则是衰老的病机。衰老是一个复杂的生命过程，其与机体抗氧化与氧化系统失衡导致体内过量自由基、炎症因子堆积相关。现代药理学研究表明黄精多糖体外具备和VC相当的清除自由基能力，具有较好的抗氧化作用[12]。本研究进一步通过体外抗氧化实验发现提取的黄精总黄酮可清除DPPH、羟自由基和ABTS，具备显著的抗氧化能力，尤其是其对羟自由基的IC50几乎是水溶性抗氧化剂VC的5倍、脂溶性抗氧化剂BHT的11倍。因此，本研究获得的酒黄精总黄酮是一种潜在的天然自由基强清除剂，为黄精抗氧化应用提供了理论依据。顺铂是临床治疗非小细胞肺癌的一线药物[13]，但有25%～30%的患者出现肾毒性，如急性肾损伤、尿毒症等[14-15]。本研究病理结果显示顺铂主要损伤肾小管，使上皮细胞水肿变性、基底增厚、肾间质轻度纤维化，最终诱导肾小管上皮细胞发生凋亡、坏死，出现透明管型。其机制可能包括：氧化应激、炎症反应、DNA损伤、线粒体功能障碍、内质网应激及细胞凋亡等[16-17]。孙桃桃[18]研究表明黄精多糖对庆大霉素诱导大鼠肾损伤可通过抗氧化、抗炎、调节p38 MAPK/ATF2信号通路发挥保护作用。彭静等[19]研究表明黄精皂苷可通过降低糖尿病肾损伤模型大鼠的肾脏指数来改善相关病理变化，本研究首次发现酒黄精黄酮提取物通过阻断脂质过氧化连锁反应，降低顺铂对肾组织的氧化损伤，可能与其强大的清除自由基能力相关。本研究表明酒黄精总黄酮可缓解顺铂所致的小鼠急性肾损伤，为协同顺铂治疗非小细胞肺癌提供新的思路。