不同生境对银杏雌、雄株嫁接苗叶中聚戊烯醇等成分积累的影响

王孟珂，国 颖，汪贵斌，苑 柯，杨晓明，国 靖

(南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

银杏(Ginkgobiloba)为银杏科银杏属落叶乔木，起源于3.45亿年前的石炭纪，自第四纪冰川运动后，欧洲、北美和亚洲绝大部分地区的银杏树均已灭绝，只在中国保存了下来[1-2]。银杏作为最古老的裸子植物，被誉为植物界的“活化石”，由于其优美的外形、较强的适应性和广泛的用途，目前被引种到多个国家和地区[2-3]。中国是世界银杏的起源地，拥有世界90%的银杏资源[4]，主要分布在温带和亚热带气候区，分布地跨越22个省/自治区和3个直辖市。银杏叶中富含多种生物活性成分[5-7]，例如类黄酮和萜内酯、聚戊烯醇、多糖、蛋白质等。目前的研究多集中于银杏叶类黄酮和萜内酯等次生代谢产物的合成和积累，虽然对聚戊烯醇、多糖、蛋白质及类脂4种代谢物合成和积累的研究有不少报道[8-11]，但是关于不同环境因素对聚戊烯醇、多糖、蛋白质和类脂4种代谢物积累的研究还不够完善,影响这些物质积累的主要生态因子仍需要深入研究。

银杏多糖是银杏中一类重要的具有生理和药用活性的生物活性物质，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种作用[12]。姜玮等[13]研究发现，不同产地的银杏叶多糖及其单糖含量差异较大；常丽等[14]研究发现，低温和干旱胁迫均可以促进银杏叶中糖的合成和积累，干旱处理可促进蛋白质的积累。

许多落叶植物在越冬期间会储藏大量的蛋白质，以满足来年树木的萌芽生长、开花结果和抵抗逆境胁迫[15]。银杏中的蛋白质有着季节性的变化规律，是一种判断银杏生长状况的重要指标。钱龙梁等[16]研究发现在不同的试验地点，银杏叶中的蛋白质含量存在显著差异。

类脂是植物中重要的脂溶性化合物，其中的聚戊烯醇与人体内的多萜醇具有相似的结构和活性，能有效促进造血干细胞的增殖、肝细胞的再生、抑制瘤细胞的转移，对肝癌、胃癌、宫颈癌等多种癌症有一定疗效[17]。研究发现，植物中的聚戊烯醇可以作为载体对脂多糖进行共价修饰参与脂多糖的合成，同时用于肽聚糖的组装参与蛋白质的糖基化[18-20]。马尾松(Pinusmassoniana)松针中的聚戊烯醇对β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞损伤有重要的保护作用[21]。外源植物聚戊烯醇可以在动植物体内通过一系列代谢活动转化成S-多萜醇，可直接作为S-多萜醇研究模型的替代物[22]。当人体内S-多萜醇及其磷酸盐不足时，糖代谢、脂质代谢和蛋白质代谢会受到不同程度的影响，从而影响细胞的免疫、分裂和再生能力，造成细胞病变[23]。郁万文等[24]研究发现，不同季节、品种和树龄的银杏叶聚戊烯醇含量之间存在着显著的差异。罗天宇[25]研究发现，聚戊烯醇的含量不仅与品种、家系、树龄等有关，还与季节、产地及各种生物和非生物胁迫有关。

本研究将遗传基础一致的银杏雌株和雄株接穗嫁接于7种不同生境条件下的银杏实生苗，测定了银杏叶中聚戊烯醇、可溶性糖、可溶性蛋白和类脂4种物质的含量，分析了这些物质与环境因子及其相互之间的关系，找出影响银杏聚戊烯醇等物质积累的主要生态因子，以期为银杏叶用林的栽培和管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在江苏省邳州市(117°42′～118°10′E,34°10′～34°40′N)国家银杏良种基地，分别选取30年生、长势良好的雌、雄银杏各1株，于2018年3月15日采集接穗，每接穗保留两个芽，接穗封蜡并置于4 ℃冰箱内储存。分别在江西广昌、湖北安陆、云南曲靖、陕西洋县、四川开江、河北石家庄和唐山等6省的7个试验地，选取3年生银杏实生苗为砧木，进行嫁接。采用区组试验设计，3个重复，每个重复40株，株行距30 cm×50 cm。

7个试验地年均气温(MAT)14～19 ℃，降水量(MAP)400～1 300 mm。各试验地的海拔、经纬度和土壤信息参考相关研究[26-27]，从Climate AP(2.3版本，http://asiapacific.forestry.ubc.ca/research-approaches/climate-modeling)中获得各试验地的日照时长(SD)、最暖月气温(MWMT)、最冷月气温(MCMT)、温差(TD)、湿热指数(AHM)等气象数据(表1)。

表1 试验地概况Table 1 Overview of the test site

2018年，在银杏生长和代谢相对最旺盛的7—8月进行样品的采集。从各试验地中，每个重复随机选择生长正常的雌株嫁接苗和雄株嫁接苗各3株采集接穗的叶样。从顶部、中部和底部的东、西、南、北4个方向采集叶片，每个部位采集4片完整的健康叶片，立即放入冰盒，带回实验室待测。

1.2 测定方法

银杏叶片用清水洗净擦干后放入烘箱中，105 ℃杀青15 min，然后60 ℃烘干48 h。银杏干叶用粉碎机粉碎，叶片粉末过孔径0.4 mm筛后密封保存，用于4种物质含量的测定。

1.2.1 聚戊烯醇含量

称取银杏叶干粉1 g，用100 mL石油醚80 ℃索氏提取6 h，提取液减压浓缩后，加入2 mL正己烷、2 mL乙醇和10 mL 30%(质量分数)的氢氧化钠溶液80 ℃水浴皂化3 h。皂化后的产物加入50 mL正己烷萃取，加入等体积超纯水溶解残留的氢氧化钠，收集上层的萃取相，减压浓缩后用正己烷溶解并定容到10 mL容量瓶，待测。以C95-Prenol标准品为外标法[17,24]计算各样品中聚戊烯醇的含量。色谱条件如下：色谱柱为Thermo HypersilBDSC18 2.5 μm柱(4.6 mm×150 mm)；柱温25 ℃；流动相为甲醇+异丙醇(体积比36∶64)；紫外检测波长为210 nm。

1.2.2 可溶性糖含量

精确称量烘干至质量恒定的无水葡萄糖0.5 g，加少量水溶解转移到100 mL容量瓶中，加入0.5 mL浓硫酸，用蒸馏水定容。按照蒽酮法[28]，取上述溶液1 mL于50 mL容量瓶中，稀释定容。从50 mL容量瓶中分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖溶液至试管中，分别加纯化水至2 mL，然后加0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂、1.5 mL蒸馏水、5 mL浓硫酸，摇匀冷却，室温放置20 min，在490 nm波长处测定吸光度值。以吸光度值对葡萄糖溶液浓度绘制标准曲线，进行线性回归得标准曲线方程。

精确称量银杏叶粉0.02 g于离心管中，加入10 mL蒸馏水，沸水浴30 min，冷却后4 000 r/min下离心10 min。离心后静置3 min，取0.04 mL上清液加入蒸馏水定容至5 mL，摇匀后待测。以蒸馏水为对照，在630 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算可溶性糖含量。计算公式如下：

式中：c1为可溶性糖含量,mg/g；m1为从回归方程求得糖的量，mg；V1为提取液体积,mL；n为稀释倍数；m为样品干质量,g;V为吸取样品液体积,mL。

1.2.3 蛋白质含量

采用考马斯亮蓝G-250法[28]测定蛋白质含量。取银杏干叶0.5 g放入研钵中，加入2 mL蒸馏水和少许石英砂研磨，磨成匀浆后用6 mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集在同一离心管中，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液至10 mL容量瓶，蒸馏水定容，摇匀后待测。分别吸取1 mL提取液，放入离心管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀后放置2 min，在595 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算蛋白质含量。计算公式如下：

C2=C×VT/(VS×WF)×1 000。

式中：C2为样品蛋白质含量,mg/g；C为查标准曲线值，μg；VT为提取液总量，mL；WF为样品质量，g；VS为测定时加样量，mL。

1.2.4 类脂含量

采用索氏提取法[29]测定银杏叶类脂的含量。首先称量各空圆底烧瓶的质量，然后称取银杏叶粉末0.5 g，用定量滤纸包好，采用热回流溶剂浸提法，以石油醚(沸程60～90 ℃)为提取剂85 ℃索氏提取4 h。旋转蒸发仪上减压浓缩，待提取液蒸干后，取下圆底烧瓶，冷却后称质量。圆底烧瓶重量变化之差即为银杏叶片中类脂的含量。

1.3 数据处理

采用Excel 2016、Origin 2021和SPSS 23软件对数据进行分析。对各立地条件下的银杏叶片可溶性糖含量、蛋白质含量、类脂含量和聚戊烯醇含量进行单因素方差分析(ANOVA)和LSD多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 银杏叶初生代谢物的含量

2.1.1 银杏叶中聚戊烯醇含量

生长于7个试验地的雌、雄株银杏叶中聚戊烯醇的含量存在显著差异(P<0.001)。各试验点雌、雄株叶内聚戊烯醇的平均质量分数分别为3.62%和4.05%(图1A)。雌株银杏嫁接苗中聚戊烯醇质量分数最高的地区是开江(5.61%)，其次是石家庄(5.29%)，最低的是曲靖(1.34%)。与曲靖相比，开江地区和石家庄地区的雌株银杏叶中聚戊烯醇的含量分别较曲靖的高76.11%和74.67%。雄株银杏嫁接苗中聚戊烯醇质量分数最低的是曲靖(1.57%)，最高的地区是石家庄(5.78%)，其次是开江(5.34%)，石家庄地区和开江地区的雄株银杏叶中聚戊烯醇含量分别比曲靖高72.84%和70.60%。

YX.洋县Yangxian；GC.广昌Guangchang；QJ.曲靖Qujing；SJZ.石家庄Shijiazhuang；TS.唐山Tangshan；KJ.开江kaijiang；AL.安陆Anlu。不同大/小写字母表示雌/雄株中该物质含量在0.05水平上差异显著，下同。The difference of capital letters(lowercases) means that the content of the substance is significantly different at the level of 0.05.The same below.图1 7个试验地中银杏叶片内聚戊烯醇及可溶性糖含量的变化Fig.1 Changes of polyprenol contentsand soluble sugar content in Ginkgo biloba leaves from seven test sites

2.1.2 银杏叶可溶性糖含量

生长于7个试验地的雌、雄株银杏叶可溶性糖的含量存在显著差异(P<0.001)。雌株银杏叶中曲靖的可溶性糖质量分数最低，为11.84 mg/g，唐山的可溶性糖质量分数最高，为15.59 mg/g。唐山地区的雌株银杏叶中可溶性糖含量较曲靖的高1.32倍(图1B)。雄株银杏叶中可溶性糖质量分数最低的是开江(11.72 mg/g)，最高的是洋县(16.88 mg/g)。与开江相比，洋县地区的雄株银杏叶中可溶性糖的含量高1.44倍。

2.1.3 银杏叶可溶性蛋白质含量

生长于7个试验地的雌、雄株银杏叶可溶性蛋白的含量存在显著差异(P<0.001)。雌株银杏叶蛋白质含量较高的是唐山、曲靖和广昌，较低的是洋县和石家庄(图2A)。唐山地区的雌株银杏叶在可溶性糖的含量较洋县的高1.28倍。雄株银杏叶中蛋白质含量最高的是广昌，为5.15 mg/g；最低的是曲靖，为3.87 mg/g。与曲靖相比，广昌地区的雄株银杏叶中可溶性蛋白的含量提高了1.33倍。

2.1.4 银杏叶类脂含量

生长于7个试验地的雌、雄株银杏叶类脂的含量存在显著差异(P<0.05)。雌株银杏叶类脂含量较高的是洋县和石家庄，较低的是唐山和安陆(图2B)。洋县和石家庄银杏叶类脂质量分数分别为9.58%和9.14%，唐山和安陆的质量分数分别为3.13%和3.76%。洋县地区的雌株银杏叶类脂含量较唐山的高3.06倍。雄株银杏叶中类脂含量最低的是唐山和安陆，最高的是开江、石家庄和广昌。唐山和安陆的银杏叶类脂质量分数分别为4.81%和4.98%，开江、石家庄和广昌的银杏叶类脂质量分数分别为6.16%、5.83%和5.80%。与唐山相比，广昌地区的雄株银杏叶类脂含量较唐山的高1.21倍。

图2 7个试验地中银杏叶片内可溶性蛋白及类脂含量的变化Fig.2 Changes of soluble protein contents and lipids contents in Ginkgo biloba leaves from seven test sites

2.2 银杏叶片各初生代谢物之间的相关性分析

相关分析表明(表2)，银杏叶蛋白质含量与聚戊烯醇含量及类脂均呈显著负相关关系(P<0.05)，叶片聚戊烯醇含量与类脂含量之间呈极显著正相关关系(P<0.01)，而可溶性糖含量与其余各活性物质含量间相关性均未达到显著水平。

表2 7个试验地银杏叶片中蛋白质、可溶性糖、聚戊烯醇和类脂含量的相关性Table 2 Correlation of content of the protein,soluble sugar,polyprenol and lipids in Ginkgo biloba leaves from seven regions

2.3 银杏叶各种代谢产物与主要环境因子的关系

将各试验地银杏叶中代谢产物的含量与气象因子和土壤因子做相关性分析，并进行逐步回归分析结果见表3和图3。

表3 逐步回归分析统计方程Table 3 Statistical equations for stepwise regression analysis

聚戊烯醇与P、K、N和C含量呈正相关关系，与降水量、年均气温、日照时长、最冷月气温和最暖月气温呈负相关关系，且相关性均依次减弱。可溶性糖与K含量、N含量、C含量、温差和日照时长呈正相关关系，与降水量、年均气温和最暖月气温呈负相关关系。可溶性蛋白与K含量、日照时长、最冷月气温、N含量和P含量呈正相关关系，与最暖月气温和C含量呈负相关关系。银杏叶类脂与湿热指数和年均气温呈较强的正相关关系，与日照时长、降水量和P含量呈较强的负相关关系，且相关性依次降低，表明银杏叶类脂的含量受湿热指数、年均气温、日照时长、降水量和P含量影响较大。K含量和N含量是同时与银杏叶中聚戊烯醇、可溶性糖和可溶性蛋白呈显著正相关关系的土壤因素，表明土壤中K和N含量的改变均可以在不同程度上调节银杏叶中聚戊烯醇、可溶性糖和可溶性蛋白的积累。

MAT.年均气温annual average temperature;MAP.降水量rainfall;SD.日照时长sunshine duration;MWMT.最暖月气温warmest month temperature;MCWT.最冷月气温coldest month temperature;TD.温差temperature difference;AHM.湿热指数damp heat index;C.碳含量carbon content;N.氮含量nitrogen content;P.磷含量phosphorus content;K.钾含量Potassium content.图3 银杏叶各初生代谢产物含量与主要环境因子的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of primary metabolites and main environmental factors in Ginkgo biloba leaves

经逐步回归分析筛选并剔除没有显著性差异的解释变量。聚戊烯醇、可溶性糖、可溶性蛋白和类脂与主要的环境因子参数构成预测模型(表3)，该模型的决定系数R2均达到0.947以上，且具有统计学意义(P<0.05)。由模型可以看出，不同代谢物质对环境因子的敏感性不同。对于银杏叶中聚戊烯醇，土壤P含量是最主要的影响因子，且呈显著正相关关系。对于银杏叶可溶性糖和可溶性蛋白质，最暖月气温是最主要的影响因子，且呈显著负相关关系。对于银杏叶类脂，年均温是其最主要的影响因子，且呈显著正相关关系。

3 讨 论

多糖、蛋白质、类脂和聚戊烯醇是银杏中重要的代谢物质，具有多种重要的生物活性和功能[30-31]，在植物的代谢活动中发挥着重要的作用[32]。作为植物体内重要的生物活性物质，类脂的积累不仅抵御各种菌类，增强植物的抗性，还能促进聚戊烯醇的积累[33]。本研究发现，不同生境条件、不同性别中银杏叶内聚戊烯醇和类脂的含量均存在显著的差异。相关性分析表明，银杏叶中聚戊烯醇与类脂之间呈极显著正相关关系，这与聚戊烯醇含量高的试验地往往类脂含量也较高的结论是一致的[34]。相关研究发现温度、水分等因素均会对银杏叶中的多糖和蛋白质含量产生显著的影响[13,16]，这与此项研究结果一致。值得注意的是，可溶性糖与其他生物活性物质的相关程度都不高，说明银杏叶中生物活性成分的代谢不是单一地起作用，可能还受到遗传因子、环境因子等多种因素的影响[17,35-37]。

我国银杏树种植范围广泛，但质量参差不齐。相关研究表明[14,38]，银杏叶片中的生物活性物质的含量与不同的产地、温度和干旱胁迫等因素都有关。在各种环境变量中，温度与光照强度被报道为影响植物叶片中聚戊烯醇含量的主要诱因之一，良好的光照条件可以促进聚戊烯醇的积累。温度降低，银杏叶片的新陈代谢也会随之减弱，聚戊烯醇的含量呈下降趋势[24,39]，这与此次研究结果一致。高温促进聚戊烯醇的积累，低温抑制聚戊烯醇的积累。此外，此次研究还发现除了温度，土壤中P与K含量也是影响银杏叶聚戊烯醇的积累重要因素。较高的P含量可以促进聚戊烯醇的积累，而较高的K含量不利于聚戊烯醇的积累。石家庄和开江两地的雌雄株聚戊烯醇含量较其他5个产地均有所提高，这可能与这两个产地较低的钾含量、较高的磷含量和最暖月气温有关。研究表明，磷对植物的糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢均起着重要的作用，随着土壤施磷量的增加，小麦籽粒中的氮素被不断稀释，从而降低蛋白质的含量;钾素作为植物体内重要的酶活化剂，可以加速氨基酸转化为蛋白质，从而促进蛋白质的合成[40-41]。相关性分析表明，蛋白质含量与聚戊烯醇含量及类脂均呈显著负相关关系，这可能是因为一些氨基酸可以通过不同的途径转变成甘油和脂肪酸进而合成脂肪[42]。此外植物体内的聚戊烯醇可以作为辅酶，参与蛋白质碳水化合物的代谢活动[21]。本研究表明，在银杏叶用林栽培管理中不仅要关注温度的变化，还应该注意合理的施肥措施，适当地增加P肥的施加比例，降低K肥的用量。但是本研究中所涉及的品种较少且只关注气候和土壤两种因素，所筛选的立地因子有限，今后有必要深入研究温度和土壤中的P、K含量是如何影响银杏叶聚戊烯醇合成与积累的，进而研究其影响的分子机制，从而丰富银杏叶聚戊烯醇代谢调控理论，推动优质银杏叶用林的发展。