基于网络药理学和分子对接技术探讨淫羊藿苷治疗骨质疏松症的作用机制

周奕良，毛国庆

（南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏 南京 210000）

骨质疏松症（osteoporosis）是一种由多种原因引起的以骨量减少、骨强度降低及易发生脆性骨折等为特征的全身性骨骼疾病[1]。据估计[2]，大于50 岁的一半女性和20%的男性会在余生出现骨折风险。骨质疏松可导致全身关节持续疼痛，日常生活困难，严重影响生活质量。在本病的发展过程中，成骨细胞和破骨细胞的失衡是其发生的重要原因之一，性激素、炎症反应等多种因素也参与其中[3]。目前治疗骨质疏松的药物以骨吸收抑制剂为主，加少量的骨形成促进剂，但这些药物也有着许多的副作用[4，5]。因此，制定新的策略来预防该种疾病至关重要。淫羊藿又名仙灵脾，是一种临床常见的中草药，始载于《神农本草经》，性味辛甘，归肝肾经。现代中药药理学表明[6]，淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效。淫羊藿主要含有淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷和淫羊藿多糖等生物活性成分，在免疫系统、骨代谢方面具有良好的临床应用[7]。淫羊藿苷是其中主要活性单体之一，其对骨代谢、心血管系统、免疫系统、肿瘤、炎症等均具有作用[8]，但关于淫羊藿苷的分子作用机制尚不清楚。网络药理学是一门基于疾病-药物靶点网络的新兴学科，基于网络相互作用研究中药的生物学知识，在生物分子水平上阐明中药有效成分的药理作用机制。本研究构建了淫羊藿苷的网络药理模型，系统分析淫羊藿苷抗骨质疏松的潜在机制，并进行分子对接，预测结果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 淫羊藿苷相关靶点的筛选 淫羊藿苷的所有靶点通过以下4 个数据库收集：中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp -e.com/molecule.php?qn=1164）[9]、毒理基因组学数据库（CTD，http://ctdbase.org)[10]、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）[11，12]、STITCH 数据库（http://stitch.embl.de）[13]。选择智人相关基因，剔除重复基因。

1.2 骨质疏松相关基因靶点的筛选 以“骨质疏松”为搜索关键词，搜索OMIM 数据库（https://www.omim.org）、GeneCards 数据库，挖掘与骨质疏松相关的潜在靶点。访问DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com）[14]，查找已批准的骨质疏松干预药物靶点。将3 个疾病数据库靶标组合，删除重复值，得到与骨质疏松相关靶标。

1.3 蛋白质－蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 利用RStudio 软件，获得淫羊藿苷靶点与骨质疏松靶点的交点，绘制Veen 图。提取交集靶点，提交STRING 数据库（https://cn.string-db.org）[15]，构建潜在作用靶点的蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。类型设置为“智人”，最小交互阈值设置为“最高置信度”（＞0.9），其余设置为默认值。最后，将PPI 结果导入Cytoscape 3.8.2 软件，构建PPI 网络。

1.4 中心基因分析 利用MCC 算法在Cytoscape 的Cytohubba 插件中计算淫羊藿苷抗骨质疏松的PPI基因，得到相关蛋白靶点网络构建。最后，展示前10名的核心目标。

1.5 GO 富集和KEGG 富集 为了明确与淫羊藿苷相互作用的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用，本研究利用R 软件对淫羊藿苷干预骨质疏松的潜在靶点进行GO 和KEGG 富集分析。保存数据结果，使用R 软件进行可视化分析。

1.6 分子对接 将骨质疏松的10 个潜在靶蛋白与淫羊藿苷进行分子对接。目标蛋白的3D 结构从PDB 数据库下载。然后将目标蛋白导入AutoDock Tools 1.5.6 中进行氢化、电荷计算，然后将结果以PDBQT 格式存储。最后，使用AutoDock 用于分子对接，保留其结合能＜-5 kcal/mol 并使用PyMOL 可视化结果。

2 结果

2.1 淫羊藿苷的靶点获得 通过搜索TCMSP、CTD、GeneCards、STITCH，共得到相关靶点148 个。

2.2 骨质疏松的靶点获得 在GeneCards 数据库中，限定Score 值＞5 筛选后得到375 个靶点。在搜索OMIM 数据库后，发现了605 个相关基因。DrugBank数据库的搜索进行了补充，获得了22 个靶点。将结果合并剔除重复基因，得到898 个骨质疏松相关靶点。

2.3 Veen 图和PPI 图构建 取淫羊藿苷与骨质疏松疾病靶点的交点，用R 软件绘制Veen 图（图1），得到50 个交点靶点。将与相应成分作用的靶点蛋白提交STRING 版本11.5 进行PPI 网络构建，选取高置信度的蛋白相互作用数据，评分＞0.9。除去不相互作用的自由蛋白，骨质疏松和淫羊藿苷之间共有蛋白44 个。PPI 网络显示，在淫羊藿苷和骨质疏松的交叉靶点中有44 个蛋白和280 个相互作用边（图2）。

图1 淫羊藿苷和骨质疏松的韦恩图

图2 针对淫羊藿苷－骨质疏松的网络图

2.4 中心基因筛选 基于Cytoscape 的插件Cytohubba，在相互作用网络中筛选Hub 基因。使用MCC 算法找到了目标蛋白的前10 个Hub 基因，并构建Hub基因网络图（图3），结果显示STAT3、MAPK3、JUN、FOS、MAPK1、ESR1、SRC、IL-6、TGFβ1、AKT1 是淫羊藿苷干预骨质疏松的重要靶点。

图3 Hub 基因网络图

2.5 KEGG 和GO 分析 用R 软件对淫羊藿苷干预骨质疏松相关靶点进行GO 和KEGG 富集分析，GO功能富集分析得到1224 个生物过程（biological process，BP）、29 个细胞组分（cellular component，CC）及64 个分子功能（molecular function，MF）；KEGG 信号通路富集分析获得152 条信号通路，并将结果可视化。筛选出BP、MF、CC 类富集程度最高的前10 个条目，BP 中以靶蛋白为主参与骨化、细胞氧化应激、肌肉细胞调控等；MF 中靶蛋白主要参与受体配体结合活性、转录因子结合、细胞因子活性；CC 中目标蛋白被分为质膜和细胞表面、内质网腔等。根据KEGG 分析筛选出前10 个项目，主要集中于TNF 信号通路、IL-17 信号通路、AGE-RAGE 通路等，见图4。

图4 淫羊藿苷靶向蛋白基因的GO 和KEGG 分析

图4 淫羊藿苷靶向蛋白基因的GO 和KEGG 分析（续）

2.6 分子对接 淫羊藿核心成分淫羊藿苷与关键靶点进行分子对接，结果显示淫羊藿苷可以结合到对接分子中，与目标蛋白之间具有良好的对接活性，见表1。共检测了以下潜在的靶蛋白：IL-6（Icariin：1ALU）、AKT1（Icariin：1H10）、JUN（Icariin：1A02）、MAPK3（Icariin：7NRB）、SRC（Icariin：7T1U）、STAT3（Icariin：6TLC）、TGFβ1（Icariin：1KLA），它们是相互作用网络中的高度节点，在淫羊藿治疗骨质疏松中对淫羊藿苷的应答起关键作用，见图6。淫羊藿苷通过与GLN-414（长度：2.3）、TRP-413（长度：2.6）、MET-403（长度：2.7）和GLY-410（长度：2.3，2.2）形成氢键与IL-6 结合；淫羊藿苷与LYS-67（长度：2.3）、SER-170（长度：2.9）、MET-68（长度：2.1）、PHE-174（长度：2.7）、SER-177（长度：2.7）、GLY-410（长度：2.3、2.2）和GLU-173（长度：2.3）形成氢键与AKT1 结合；淫羊藿苷与JUN 形成5 个氢键，分别是TRP-399（长度：2.3）、GLN-457（长度：2.6、2.9）、HIS-549（长度：2.6、2.1）；淫羊藿苷与MAPK3形成6 个氢键，分别是GLU-122（长度：2.1）、CYS-120（长度：2.1）、GLN-68（长度：2.8）、GLU-119（长度：2.1、2.7）、LYS-187（长度：2.3）；淫羊藿苷还与SRC 通过PRO-249（长度：2.3、2.3）、GLU-150（长度：2.2）、TYR-152（长度：2.0、2.9）、GLN-147（长度：2.1）形成氢键；淫羊藿苷与STAT3 形成7 个氢键，分别是GLN-361（长度：2.4）、TYR-446（长度：3.0、2.5）、GLU-444（长度：3.3、2.6、2.6）、LYS-363（长度：2.4）。除此以外，淫羊藿苷还和TGFβ1 通过GLY-46（长度：1.8）、CYS-78（长度：2.1，2.7）、PRO-76（长度：2.2）、ALA-75（长度：2.7）、ALA-72（长度：2.9）形成氢键。此外，以上所有蛋白靶点与淫羊藿苷进行分子对接，其结合能均＜-5 kcal/mol。

图6 淫羊藿苷与预测蛋白靶结合的分子模型

图6 淫羊藿苷与预测蛋白靶结合的分子模型（续）

表1 淫羊藿苷核心靶点的结合能

3 讨论

本研究通过整合公共数据库中关于骨质疏松的信息来预测淫羊藿苷与其潜在蛋白靶标之间的相互作用，并阐明淫羊藿苷参与的众多信号通路。此外，通过分子对接研究，以预测淫羊藿苷与其预测的靶蛋白之间的特定相互作用。

淫羊藿苷的分子对接结果表明，氢键是相互作用的主要形式。通路分析表明，淫羊藿苷对骨质疏松中的TNF 信号通路、IL-17 信号通路、Prolactin 通路，AGE-RAGE 通路等具有调控作用。同时，淫羊藿苷可通过多靶点、多通路干预骨质疏松的过程。其中，排名前10 位的靶点分别为STAT3、MAPK3、JUN、FOS、MAPK1、ESR1、SRC、IL-6、TGFβ1、AKT1，以上可能是药物发挥治疗作用的核心靶点。

淫羊藿苷治疗骨质疏松的潜在原因可能归于以下方面：首先，这些潜在靶点与成骨细胞、破骨细胞密切相关。STAT3 参与多种细胞因子的信号传导过程，在骨髓细胞分化中发挥重大作用[16]。李常虹等[17]研究表明，STAT3 在小鼠破骨细胞前体细胞模型中被证实通过降低NFATc1 的表达，进而抑制RANKL诱导破骨细胞生成。TGFβ1 是一种广泛分布的骨基质蛋白，影响破骨细胞和成骨细胞的功能、形成和细胞间相互作用，以调节骨重塑和维持足够的骨量[18]。MAPK3（ERK1）和MAPK1（ERK2）可以通过激活Runx2 基因来促进成骨细胞发育，进而促进抗骨质疏松[19]。Kim HK 等[20]研究表明，MAPK3 和MAPK1可以受胶原蛋白水解物的刺激产生磷酸化，最终导致成骨细胞的增值和分化。破骨细胞分化因子RANKL 依赖于c-FOS 的基因转录，此外受外界刺激的c-JUN 细胞信号分子，可以进一步磷酸化，通过MAPKs 信号通路，在破骨细胞的分化过程中发挥作用。有研究表明[21]，c-FOS 和c-JUN 形成的异源二聚体刺激破骨前体细胞的成熟，诱导破骨细胞的分化。程琳燕[22]发现淫羊藿苷可以明显抑制c-FOS和NFATc1 的表达，进而参与破骨细胞的生成。IL-6是一种多功能细胞因子，可调节破骨细胞祖细胞，并通过调控MAPK 磷酸酶和泛素途径相关的特定基因的转录来抑制其分化骨稳态[23]。其次，这些潜在靶点能通过影响炎症因子、激素来调节骨形成与骨吸收。有研究表明[24，25]，ESR1 是通过TGFβ 途径和抑制IL-6 的活动来调节骨代谢。AKT 是骨稳态的是重要一环，在AKT1 敲除的模型小鼠中，小鼠变得骨化延迟[26]、骨骼变短[27]、骨量减少[28]。另SRC 能调节雌激素依赖的ERα 靶基因的表达，有研究表明[29]，SRC 通过雌激素对骨形成起到调控作用。

综上所述，淫羊藿苷可通过多靶点、多途径调节骨代谢稳态平衡，发挥抗骨质疏松作用。