基于网络药理学探讨栀子治疗溃疡性结肠炎的作用机制

张科楠，袁倩文

（1.北京中医药大学孙思邈医院药学部，陕西 铜川 727100；2.铜川市中医医院针灸推拿科，陕西 铜川 727100）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以结肠和直肠持续性粘膜溃疡为主的慢性及复发性炎症疾病[1]。近年来随着生活水平的提高，UC 在我国发病率也逐年上升[2]，且呈年轻化趋势，该病可反复发作，难以根治，并具有一定的癌变可能，对人民生命健康构成严重威胁[3]。已被世界卫生组织定义为现代难治疾病之一[4]。UC 的发病机制尚不清楚，主要与遗传、免疫、环境及肠道粘膜屏障损害有关[5]。传统西医以口服氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂药物和手术为主[6]，依从性较差，副作用较大且复发率较高。而中医药可通过多途径、多层次在降低复发率、促进肠粘膜修复、减轻临床症状等方面发挥重要作用，成为UC 治疗的重要手段[7]。栀子为茜草科植物，最早记载于《神农本草经》，性味苦寒，具有清热利湿、泻火除烦、凉血止血的功效[8]。现代药理学研究显示[9]，栀子的主要活性成分有环烯醚萜类、有机酸类、黄酮类、挥发油及微量元素等。在抗炎[10，11]、解热镇痛[12]、抗氧化[13]、降压[14]等方面具有重要作用。研究表明[15-18]，栀子对溃疡性结肠炎具有一定的治疗作用。但其发挥作用的物质基础和作用机制尚不明确。因此本文以网络药理学和分子对接技术研究栀子抗UC 的机制，旨在为栀子临床应用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 栀子活性成分及作用靶点的收集 将栀子中文名输入TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性指数（drug-likeness，DL）≥0.18 为指标，进行活性成分及作用靶点的收集[19]。结合文献对栀子治疗溃疡性结肠炎的相关成分进行整理、收集。运用uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）将收集靶点的蛋白名转化为基因名。

1.2 UC 相关靶点的收集及共同靶点的Veen 分析基 于GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、drugbank（https://go.drugbank.com/）、TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库，以“ulcerative colitis”为检索关键词，获得与UC 相关的作用靶点。将栀子的潜在靶点与UC 的相关靶点数据进行Venn 分析，得到栀子治疗UC 的潜在作用靶点。

1.3 疾病-药物-成分-靶点网络的构建 运用Cytoscape3.7.2 软件构建药物成分-疾病-靶点可视化网络，并且根据Degree 值筛选关键药效成分。

1.4 栀子成分治疗UC 靶点蛋白互作（PPI）网络图构建 将“1.2”项得到的潜在作用靶点导入String 数据库，将检测物种限定为人类（Homo sapiens），最小互相作用阈值设为“medium confidence”（＞0.4），得到蛋白互作网络图及TSV 格式的PPI 数据表。将此数据表导入Cytoscape3.7.2 软件中，运用“Network analyzer”功能进行拓扑学分析。

1.5 基因本体（GO）和基因组百科全书（KEGG）功能富集分析 将“1.2”项下得到的潜在作用靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），以P＜0.05为筛选条件，对潜在作用靶点进行GO（包括生物过程、细胞组分、分子功能）功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

1.6 分子对接 从PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白的3D 结构图，利用Pymol 软件去除靶蛋白中的配体和非蛋白分子，导入AutoDockTools1.5.6 进行处理后保存为pdb 格式。利用AutoDockTools1.5.6 以及AutoDockVina1.1.2 进行分子对接。

2 结果

2.1 栀子活性成分及靶点的收集 利用TCMSP 数据库，共收集到栀子中18 个活性成分，结果见表1。通过uniprot 数据库再收集活性成分相关的作用靶点，去除重复后共得到253 个靶点。

表1 栀子中活性成分的基本信息

2.2 栀子治疗UC 的潜在作用靶点 将GeneCards、OMIM、drugbank、TTD 数据库收集到的溃疡性结肠炎靶点进行整理，去重后得到相关靶点1586 个，运用Veen 作图平台对栀子活性成分的潜在靶点与溃疡性结肠炎的相关靶点取交集，得到128 个潜在作用靶点，见图1。

图1 栀子治疗UC 的潜在作用靶点

2.3 活性成分-靶点-疾病网络的构建 运用Cytoscape3.7.2 软件构建活性成分-交集靶点-疾病网络图，结果见图2（菱形代表栀子活性成分，圆形代表活性成分作用于UC 的靶点，正方形代表疾病），该网络中共有147 个节点，其中活性成分节点18个，疾病靶点128 个。利用Cytoscape3.7.2 软件的“Networkanalyze”计算分析功能可知，该网络平均度值为5.41，平均紧密度为0.469，平均介度为0.008，对活性成分度值进行排名，度值越高成分越重要，选取度值排名前5 的成分进行展示，结果见表2。

表2 活性成分网络节点特征参数

图2 活性成分-交集靶点-疾病网络图

2.4 PPI 网络的构建 将128 个交集靶点导入STRING 数据库进行分析，得到PPI 网络图，利用Cytoscape 软件进行可视化分析，根据Degree 值调整，颜色越深、越大表示该靶点越重要，见图3。结果显示该网络平均度值为40.70，平均紧密度为0.590，平均介度为0.006。其中27 个靶点的度值、紧密度、介度均大于平均值。选取排名前10 的靶点展示，结果见表3。结果显示TNF、IL6、AKT1、IL1B、TP53、VEGFA、MMP9、JUN、PTGS2 等靶点在网络中最为重要，可能是栀子治疗UC 的关键靶点。

表3 PPI 网络核心节点特征参数

图3 PPI 网络的构建

2.5 富集分析结果 GO 功能分析共得到2470 个富集结果，其中生物过程（BP）2259 项，主要包括response to molecule of bacterial origin（对细菌来源的分子的反应）、response to oxidative stress（氧化应激反应）、response to extracellular stimulus（对细胞外刺激的反应）；细胞组成（CC）53 项，主要包括membrane raft（膜筏）、membrane microdomain（膜微区）、vesicle lumen（囊泡腔）等；分子功能（MF）158 项，主要包括RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding（RNA 聚合酶II-特异性DNA-结合转录因子结合）、cytokine receptor binding（细胞因子受体结合）、DNA-binding transcriptionfactor binding（DNA-结合转录因子结合）等。根据P值进行排序，取排名前10 的生物过程、分子功能和细胞组分进行展示，见图4。

图4 GO 富集分析气泡图

2.6 KEGG 通路富集分析结果 KEGG 通路富集分析共获得161 条信号通路。筛选出前20 条KEGG 通路将其进行可视化处理，结果见图5。结果显示，栀子治疗UC 主要涉及Lipid and atherosclerosis（脂质和动脉粥样硬化）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并发症中的AGERAGE 信号通路）、Hepatitis B（乙肝通路）、IL-17 signaling pathway（IL-17 信号通路）、TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）。

图5 KEGG 通路富集分析气泡图

2.7 分子对接验证 将“2.3”项下筛选得到的5 个核心化合物成分进行分子对接。对接信息结果见表4，表中结合自由能越小，受体蛋白与配体结合更稳定、牢固。表明药物成分与关键靶点具有强的结合力。从结果中显示栀子活性成分与核心靶点均具有较强的结合力，其中西红花苷与IL6、TP53 结合效果最佳，对接自由能为-9.8、-8.9 kcal/mol。为了从分子水平阐述西红花苷与IL6 与TP53 的作用形式，绘制对接模式图，见图6。

表4 活性成分与靶点结合能

图6 活性成分与靶点的分子对接模式图

3 讨论

本研究采用网络药理学及分子对接技术共筛选出栀子中18 个活性成分，“药物-疾病”交集靶点128 个，在“活性成分-交集靶点-疾病网络图”中显示，槲皮素、山奈酚、西红花苷、京尼平苷、β-谷甾醇为抗UC 的主要活性成分，槲皮素、山奈酚做为黄酮类化合物均具有很好的抗炎作用[20，21]。研究表明[22-24]，槲皮素是缓解结肠炎性损伤的重要成分之一。Park MY 等[25]研究显示，山奈酚可减轻硫酸葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的UC 小鼠血浆中一氧化氮（NO）、前列腺素（PGE）的水平，提高肠道细胞保护功能，改善氧化应激水平。杨敏杰等[26]表明西红花苷可抑制炎症因子的表达，抑制氧化应激及细胞凋亡从而治疗溃疡性结肠炎。京尼平苷作为栀子苷的主要活性成分，它可改善DSS 诱导的小鼠溃疡性结肠炎[27]。通过减少促炎因子的释放，恢复受损的肠道屏障功能，减轻大鼠肠道炎症性疾病。β-谷甾醇作为植物甾醇含量最为丰富的甾醇之一，具有极强的抗炎、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病及抗癌作用[28]。研究表明[29]，β-谷甾醇可抑制TNBS 诱导的溃疡性结肠炎，抑制IL1B、TNF 等炎症因子的分泌。

PPI 结果显示，ALB、TNF、IL6、AKT1、IL1B、TP53 等为关键靶点。ALB 在抗炎、氧化应激方面起着重要作用，它可作为初诊UC 患者的预测指标[30]。有研究显示[31]，ALB 与炎症性肠病肠黏膜愈合具有相关性。但与UC 的相关研究较少。TNF 作为重要的促炎因子，在病理状态下可刺激机体组织发生炎症反应[32]。从而导致肠粘膜通透性增加，导致肠道损害加重，进一步发展导致溃疡性结肠癌的发生[33，34]。IL6作为强大的炎症因子，参与UC 的炎症反应，UC 患者血清中IL6 水平显著高于正常人群，且与溃疡程度呈正相关[35]。AKT1 已被证实在UC 患者肠粘膜中显著表达，在结肠癌的诊断和预后中具有重要意义[36]。IL1B 目前已作为判断溃疡性结肠炎溃疡程度与疗效的临床指标[37]。研究显示溃疡性结肠炎患者IL1B含量显著升高。且与溃疡程度呈现正相关[38]。P53 的表达可作为结肠癌早期的生物标志物[39]。

KEGG 通路富集分析主要涉及脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE）、乙肝通路、IL-17 信号通路（IL-17）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF）。这说明栀子治疗UC 可能通过抗炎、抗肿瘤等方面实现。此外，在KEGG 前20 条通路中显示多条通路与癌症相关，推测UC 的发展可进一步导致结肠癌，且目前癌症研究较深入，靶点较多。研究显示[40]，TNF 参与UC 的发展过程，抑制TNF 则有利于控制炎症的进展，目前抗TNF 单抗已用于UC 的治疗，并取得很好的疗效。IL-17 信号通路是重要的炎症通路，作为炎症因子可刺激细胞粘附分子1（cellular adhesion molecule 1，ICAM-1），引发炎症级联反应[41]。AGEs 作为高度异质性的活性物质，可产生持续性的氧化应激，导致血管组织受损。当与其受体RAGE 结合后，激活AGE-RAGE 而损害肠道黏膜，同时激活NADPH 氧化酶和NF-κB，加重氧化应激反应，对肠道的微小血管造成一定的破坏[42]。

本研究采用网络药理学和分子对接对栀子的成分、靶点及治疗UC 的途径进行探索性研究，结果显示栀子可通过多成分、多靶点、多生物过程及通路共同影响UC 的进程。为栀子改善UC 的后续临床研究提供一定的理论基础。